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目的1.在He La人类宫颈癌细胞和OCI-Ly3人类弥漫大B细胞淋巴瘤(Diffuse Large B Cell Lymphoma,DLBCL)细胞中,应用转录激活因子样效应蛋白核酸酶(Transcription activator-like effector nuclease,TALEN)技术在基因组水平上敲除micro RNA-21(mi R-21)基因,分别建立mi R-21敲除的稳定细胞系,探讨运用TALEN技术在不同的人类肿瘤细胞中敲除micro RNA基因的可行性。2.在获得mi R-21基因敲除稳定细胞系的基础上,比较野生型(Wild type,WT)细胞和mi R-21敲除(Knock out,KO)细胞在细胞及分子生物学水平上的差异,探讨mi R-21基因在相关肿瘤形成中的作用机制,为肿瘤诊断提供新指标或为治疗提供新靶点。方法1.利用基因工程技术设计、构建分别靶向人类mi R-21基因的种子序列、茎环序列及其前体序列下游的三对TALEN表达质粒。2.分别将其转染He La人类宫颈癌细胞和OCI-Ly3人类弥漫大B细胞淋巴瘤细胞;通过Surveyor突变检测法检测TALEN诱导的突变效率。3.PCR法筛选TALEN转染后细胞所形成的单细胞克隆,建立在基因组水平上敲除了mi R-21基因的稳定细胞系。4.使用q RT-PCR法检测所筛选到的mi R-21敲除细胞克隆中的成熟mi R-21表达水平,并将双荧光素酶mi R-21报告基因载体转入到mi R-21基因敲除的He La细胞中,进一步验证mi R-21基因的敲除。5、应用MTS法绘制细胞生长曲线、单细胞平板克隆形成实验观察mi R-21基因敲除对He La细胞生长、增殖的影响;软琼脂克隆形成实验观察mi R-21基因缺失对He La细胞锚定依赖性生长的影响;使用肿瘤化疗药物顺铂处理细胞后,用MTS法和Annexin/PI双染流式细胞检测法观察mi R-21基因敲除的He La细胞对顺铂的敏感性的变化;最后还分别将野生型和mi R-21基因敲除的He La细胞在非肥胖型糖尿病/重症免疫缺陷/白细胞介素-2受体γ链缺失(NSG)小鼠中进行皮下致瘤实验,比较它们在小鼠体内生长的差异。6.Micro RNA深度测序分析mi R-21基因敲除对He La细胞中其他micro RNA表达量的影响;m RNA高通量测序比较野生型He La细胞与mi R-21基因敲除He La细胞间的基因谱表达差异;通过q RT-PCR和Western blot验证mi R-21相关靶基因的表达水平变化。结果1.酶切分析和测序结果显示:成功构建了分别靶向人类mi R-21基因种子序列(TALEN Pair1,P1)、茎环序列(TALEN Pair2,P2)及其前体的下游核酸序列(TALEN Pair3,P3)的三对TALEN表达质粒。2.Surveyor突变检测结果显示我们所构建的三对TALEN均能特异地靶向剪切人类基因组DNA,在He La细胞中其介导的突变率分别约为5.1%、7.0%和7.2%。另外,将TALEN P1和P3共转染He La细胞,基因组DNA突变率提高到8.4%,将TALEN P2和P3共转染,突变率提高到14.0%。3.为了剪切He La细胞基因组上的mi R-21序列,在LipofectamineTM2000的介导下我们把TALEN P1和P3同时共转染He La细胞,通过PCR法筛选TALEN转染细胞后所形成的92个单细胞克隆,获得11个带有mi R-21基因片段缺失的克隆,q RT-PCR检测法对这些克隆进行了细胞中成熟mi R-21表达水平的检测,结果显示He La#75的mi R-21表达量仅相当于野生型细胞的0.1%。进而对克隆#38,#39,#75和#92进行TA克隆测序,取得了其突变部位的核酸序列,从而获知我们所使用的He La细胞株的mi R-21基因共有三个拷贝。4.Micro RNA深度测序及双荧光素酶mi R-21报告基因载体表达检测均进一步证明:He La#38中mi R-21表达明显下调,而He La#75中mi R-21几乎检测不到。5.为了获得更多mi R-21基因敲除的He La细胞克隆,我们对残留一个mi R-21基因表达拷贝的He La#38进行了第二轮TALEN诱导的mi R-21基因敲除。通过PCR法筛选,从164个单细胞克隆中又筛选到3个mi R-21敲除的He La细胞克隆:#3837、#3838和#38124。6.MTS法绘制细胞生长曲线和单细胞平板克隆形成实验结果显示:和野生型相比,mi R-21敲除的He La细胞生长速度明显变慢。同时,软琼脂克隆形成实验结果显示:mi R-21敲除的He La细胞的非锚定依赖性生长能力减弱,提示该细胞的侵袭性下降。7.使用顺铂处理He La细胞后,MTS法绘制细胞生长曲线和Annexin/PI双染流式细胞检测结果显示:和野生型相比,mi R-21基因敲除的He La细胞对顺铂的敏感性提高了。8.He La WT和#75、#3837的m RNA高通量测序结果Sylamer分析显示:#75和#3837中带有mi R-21靶序列的基因表达量普遍上调。9.通过对比mi R-21敲除克隆#75和#3837与野生型He La细胞的m RNA高通量测序结果,发现在mi R-21敲除克隆中有165个基因的表达量比野生型上调了2倍以上,其中有10个是Target Scan或mi Records数据库中预测或已证明了的mi R-21靶基因,我们又从中挑选了4个与细胞增殖相关的基因:ACTA2、RECK、TAGLN和TGFB2进行实时定量PCR验证,结果显示这4个基因的RNA水平均明显上调,与高通量测序结果一致。10.Western blot对公认的mi R-21靶基因PDCD4和PTEN的蛋白水平检测显示:在mi R-21基因敲除的He La细胞克隆(#75、#3837、#3838)中,PDCD4和PTEN蛋白表达水平明显上调。11.He La细胞接种非肥胖型糖尿病/重症免疫缺陷/白细胞介素-2受体γ链缺失(NSG)小鼠后的体内致瘤实验结果显示:皮下致瘤3周后,WT组和mi R-21表达下调的#39组及mi R-21敲除的#75组均可以在NSG小鼠皮下形成肿瘤,虽然肿瘤的大小没有显著性差异,但是肿瘤病理切片HE染色显示与WT和#39相比较,#75的细胞密度较低、细胞和胞核体积较小、核仁较模糊、有丝分裂期细胞比例较低,以上特点均提示mi R-21敲除细胞在小鼠体内的侵袭性较低。12.为了获得mi R-21敲除的OCI-Ly3细胞克隆进行mi R-21基因在弥漫大B细胞淋巴瘤中功能的相关研究,我们使用Nucleofector电转染把TALEN P1和P3以及e GFP表达质粒同时共转染OCI-Ly3细胞,流式分选GFP表达阳性细胞后,再通过PCR法筛选TALEN转染后细胞所形成的984个单细胞克隆,筛选获得4个mi R-21敲除的OCI-Ly3细胞克隆:#33、#64、#104和#126。结论为了研究mi R-21基因在人类肿瘤细胞中的功能,我们构建了三对靶向mi R-21基因不同位点的TALEN表达质粒,并应用它们在He La和OCI-Ly3两种人类肿瘤细胞株中成功建立了可用于体内及体外实验的多个mi R-21敲除的细胞克隆。对mi R-21敲除的He La细胞的分析结果显示:不表达mi R-21基因的Hela细胞生长、增殖变慢,对肿瘤化疗药物顺铂更加敏感。我们还通过高通量m RNA测序分析mi R-21敲除后的He La细胞与野生型细胞基因表达谱的差异,发现mi R-21基因缺失显著影响了细胞信号转导、细胞粘附、细胞外基质形成、血管形成和血液循环等相关基因的表达。我们的实验结果不但显示TALEN介导的micro RNA基因敲除技术可以被应用于人类细胞中micro RNA基因功能的研究,同时还揭示了受mi R-21调控的可能与肿瘤发生、发展相关的新通路。另外,所建立的多个mi R-21基因敲除的OCI-Ly3单细胞克隆为DLBCL中mi R-21基因的作用研究搭建了良好的平台。