猪骨膜去细胞支架的制备及与细胞的共培养研究

• 作 者: 孙郁文
• 机 构: 宁波大学
• 出 处: 宁波大学
• 发表日期: 2019年8期
• 关键词: 人工骨修复材料

研究目的：
　　人工骨修复材料是临床上用于治疗骨缺损的重要手段，特别是一些肿瘤术后的骨缺损，由于对骨量需求大，自体骨供量不足，难以满足临床治疗的需求，人工骨修复材料起到了重要作用。但目前人工骨种类繁多，不同的人工骨一定程度上都存在一定的局限性，如同种异体骨，虽然存在良好的力学特性，但也存在排异性；磷酸钙、羟基磷灰石等无机材料可塑性强，可制成各种形状用于骨填充，降解性、骨结合能力好，不过单独使用时存在脆性，力学性能差，不宜用于承重区；组织工程骨作为新型骨修复材料，将生物工程、纳米技术等引入于骨修复材料制作，使其在具备良好力学特性、骨传导、降解性、组织相容性的基础上，可以有更好的靶向性，局部对肿瘤细胞产生抑制。
　　猪骨膜通过脱细胞技术制备了去细胞骨膜，骨膜去细胞生物支架可以作为组织工程的支架材料为种子细胞黏附、增殖、长入和分化提供良好的三维空间支持，也可为复合生长因子发挥生物效应提供平台，是未来骨组织工程技术优良的候选支架材料。本研究探索基于猪骨膜的去细胞支架的制备及检测，以及观察骨架与滑膜成纤维细胞（HFLS）共培养的情况，为之后建立载药微球-支架复合支架，及支架性能的研究奠定基础。
　　研究方法：
　　1、取市场上新鲜并带肉的猪扇骨，剥离肌肉、筋膜及结缔等组织，切取猪扇骨上的骨膜，将其通过物理冻融（-80℃,24h-48h）、去污剂洗脱（Triton-X100,SDS）和酶消化（RNA酶，DNA酶）获得猪骨膜去细胞支架。
　　2、通过扫描电子显微镜下观察猪骨膜去细胞支架的显微结构。
　　3、通过HE染色和DNA提取（n=6）测定去细胞骨膜支架结构及DNA成分残留。
　　4、通过Masson染色和羟辅氨酸测定法（n=6）定性定量检测骨膜细胞外基质的主要成分（胶原）的保留情况。
　　5、将猪骨膜去细胞支架与成纤维细胞共培养48h（n=6），通过MTT观察细胞存活与增殖的情况。
　　研究结果：
　　1、电镜下骨膜组织经去细胞处理后，组织表面的连续性并未中断，并存在大小不等的孔隙，孔隙率良好；
　　2、通过HE染色后观察表明猪骨膜去细胞支架无残留核酸，通过DNA提取结果亦表明猪骨膜去细胞支架无DNA残留；
　　3、通过Masson染色和羟辅氨酸测定表明猪骨膜去细胞支架中胶原成分，并与正常猪骨膜组织对比，显示去细胞支架中的胶原成分被基本保留。
　　4、将猪骨膜去细胞支架与人滑膜成纤维细胞（HLFS）的体外共培养，细胞活性可以始终良好的维持。
　　研究结论：
　　1、去细胞骨膜支架有良好的孔隙结果，有利于骨细胞的长入与分化。
　　2、去细胞骨膜支架中核酸清除彻底，有良好的相容性，排异性低。
　　3、去细胞骨膜支架中胶原成分基本保留，有利于骨的长入与传导，易形成有生物活性的结合界面，发挥成骨功能。
　　4、去细胞骨膜支架与HLFS）的体外共培养可保留其生物活性，存在良好的组织相容性。