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第一部分哮喘儿童外周血Th17水平及其表达IL-17功能研究第一节流式细胞术检测人Th17细胞方法探讨目的:探讨流式细胞术检测人Th17细胞方法。方法:收集健康儿童外周血,分离外周血单个核细胞(PBMC),使用不同剂量PMA、不同刺激培养时间处理后用流式细胞仪检测Th17细胞百分率,检测早期活化标记细胞膜CD69以及表达IFN-γ的Th1细胞作为细胞活化的参照,获得最佳刺激剂量和培养时间。结果:Th17与Th1的活化条件不相同,PMA 10-100μg/L加上Ionomycin和高尔基体阻断剂,培养4-12 h以内可获得Th17较好检测结果,过高的刺激剂量以及培养时间不能提高检测水平反而影响Th17的检测。结论:本研究探讨的流式细胞术检测人Th17的方法指导临床和科学研究。第二节哮喘儿童外周血Th17水平及表达IL-17功能研究目的:观察哮喘急性发作期患儿外周血Th17水平和功能状态,初步探讨Th17在儿童哮喘发病中的作用。方法:以正常儿童(对照组,n=20)为对照,流式细胞术(FCM)检测哮喘急性发作期患儿(哮喘组,n=30)外周血Th17以及Th1,Th2细胞百分率,Q-PCR方法检测外周血单个核细胞(PBMC)IL-17 mRNA的表达,ELISA方法检测体外培养上清IL-17,IFN-γ以及血浆IL-17,IL-23,IgE水平。结果:(1)哮喘组和对照组外周血CD4+T中CD4+IL-17+T百分率([1.25±0.66)% vs (1.27±0.66)%(P>0.05)];CD4+IL-4+T比例([2.40±2.55)% vs (2.52±1.26)% (P>0.05)];两组比较无统计学意义。哮喘组CD4+IFN-γ+T比例显著低于对照组[15.79±7.48 vs 24.10±12.70(P<0.05)]。(2)哮喘组PBMC表达IL-17 mRNA显著低于对照组(8.26(4.40-49.43) vs 4.78(1.0-35.49) Z=1.93 P=0.05);PHA刺激PBMC体外培养72 h上清中,哮喘组IL-17水平显著低于对照组[17.53(0~245.57)ng/L vs 101.74(25.12~500.60)ng/L(P<0.01)];IL-17 mRNA与蛋白水平呈正相关(r=0.76 P=0.01)。IFN-γ水平与对照组比较无统计学意义[3507±2788 ng/L vs 3027±2737 ng/L];两组血浆中IL-17均<2 ng/L,IL-23均<15 ng/L。(3)哮喘组血浆总IgE 499.26(2.3~945.1)IU/mL,显著高于对照组54.57(1.7~318.26)IU/mL(P<0.001);IgE阳性(>150 IU/mL)和阴性(<150 IU/mL)哮喘患儿体外PBMC培养上清中IL-17,IFN-γ水平比较无统计学意义。结论:哮喘急性发作期患儿外周血Th1细胞以及PHA活化的IL-17表达水平降低,Th1水平和Th17功能异常的机制及其在儿童哮喘发病中的作用值得进一步研究。第二部分IL-17 G-152A基因多态性与儿童哮喘发病相关性研究目的:分析中国西南地区汉族人群IL-17 G-152A多态性(rs2275913)与儿童哮喘发病的相关性。方法:采用PCR-限制性片断长度多态性(Restricion Fragment Length Polymorphism,RFLP)法分析88例哮喘患儿(哮喘组,其中51例为变应性哮喘),89例毛细支气管炎患儿(毛细支气管炎组)和184例健康对照(对照组)IL-17 G-152A位点基因型。ELISA法检测PHA诱导不同基因型PBMC表达IL-17水平。比较不同基因型哮喘患儿血清总IgE、肺功能及毛细支气管炎患儿临床特点。结果:(1)IL-17 G-152A位点在中国西南地区存在多态性,各组基因型频率符合Hardy-Weinberg平衡。健康人群A、G等位基因频率分别41.6%、58.4%;AA、AG和GG基因型频率分别14.7%、53.8%、31.5%(2)哮喘组G-152A位点等位基因以及基因型频率与正常组比较有统计学差异,OR值及95%CI在A等位基因为1.44(1.00-2.06),P=0.048;在AA基因型为2.44(1.32-4.50),P=0.004。相对于变应性哮喘,A等位基因和AA基因型显示更高的OR值。(3)基础肺功能,血清总IgE平均水平在各基因型组间比较差异无统计学意义;但AA基因型中血清总IgE增高(>150 IU/mL)个体及肺功能FVC、FEV1降低(<80%个人预测值)个体的比例显著高于AG和GG基因型(P<0.05)。(4)PHA诱导的PBMC表达IL-17水平在各基因型组无显著差异(5)毛细支气管炎组基因型和等位基因频率与正常组或哮喘组比较无统计学差异;结合临床资料分析显示AA基因型患儿鼻咽部肺炎链球菌检出率较高(37.5% vs 2.5%,P=0.001);AA基因型患儿住院时间较长(8.89±1.76 vs 7.15±2.05, P=0.02),GG基因型喘息病程较短(9.85±3.36 vs 11.64±2.64,P=0.03)。结论:本研究在基因水平提示IL-17与哮喘发病有关。IL-17 G-152A多态性(rs2275913)是中国西南地区儿童变应性哮喘发病的危险因素,AA基因型与哮喘患儿血清总IgE升高以及肺功能FVC、FEV1异常有关。在毛细支气管炎患儿中发现该位点不同基因型间临床表现存在差异,可能与发生哮喘有关。有待增加样本量,以及进一步探讨IL-17 G-152A多态性对IL-17表达调节、IL-17基因其它多态性位点的作用,以进一步揭示IL-17在儿童哮喘发病中的作用和机制。