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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)是一种重要的人畜共患病的病原体,具有公共卫生意义。EMCV感染的宿主范围广泛,在某些哺乳动物、啮齿动物、灵长类动物乃至人类可引起脑炎、心肌炎或心肌周围炎。猪对EMCV最易感,可造成仔猪急性死亡和实质器官的广泛病理损伤,怀孕母猪的流产、产死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍性疾病。已有的研究表明,EMCV感染可诱导宿主细胞自噬,但病毒蛋白在自噬中的作用以及调控病毒复制的分子机制尚不清楚。本论文研究病毒蛋白参与EMCV诱导的细胞自噬和凋亡及其分子机制,以期为阐明EMCV的致病机制提供科学依据。利用透射电镜、Western blotting和激光共聚焦免疫荧光等技术对EMCV病毒蛋白诱导BHK-21细胞的自噬活性进行分析。结果显示,EMCV的2C和3D蛋白能在其转染表达的细胞胞浆中产生大量的单层膜和双层膜的自噬体样囊泡,而且显著提高了LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ分子的转化及p62分子的降解；在转染的细胞中2C和3D蛋白能与LC3呈点状共定位分布,表明EMCV的2C和3D蛋白参与病毒诱导细胞自噬的过程。进一步研究结果表明,EMCV的2C和3D蛋白可引起内质网应激和未折叠蛋白反应的激活。利用免疫共沉淀、激光共聚焦免疫荧光等技术证实EMCV的2C蛋白与宿主细胞蛋白Beclin1相互作用。研究结果发现,在EMCV感染或过表达2C蛋白的BHK-21细胞中,Beclinl发生裂解并伴随细胞凋亡水平增加。进一步利用RNAi、Western blotting和流式细胞术等技术分析了沉默BHK-21细胞中Beclinl基因表达对细胞凋亡及病毒复制的影响,结果显示,Beclinl表达量的下降可促进Bax从胞质转移到线粒体,从而增加EMCV诱导细胞凋亡的水平,同时也提高了感染后期EMCV的病毒滴度；而加入细胞凋亡抑制剂(Z-VAD-FMK)或沉默caspase-3基因表达后均可抑制病毒复制,说明细胞凋亡在EMCV感染中起着重要作用,并与EMCV复制有着密切的关系。综上所述,我们的研究表明,EMCV非结构蛋白2C和3D参与病毒诱导的细胞自噬,而且EMCV感染或过表达2C蛋白后可通过降解宿主细胞蛋白Beclinl而促进细胞凋亡,最终有利于病毒复制。本论文的研究结果为阐明EMCV对宿主细胞的分子致病机理提供了科学依据。