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目的:本研究选择正常及肝纤维化引发的内质网应激模型大鼠为研究对象,以白藜芦醇为工具药物,考察肝纤维化疾病模型下内质网应激对UGTs代谢酶表达及活性的影响;通过在体外孵育实验中分别加入UGT1A1特异性抑制剂胆红素、UGT1A7和UGT1A9的选择性抑制剂厚朴酚,和UGT1A9特异性抑制剂尼氟酸,考察通过大鼠肝微粒体和细胞裂解酶介导的白藜芦醇体外孵育实验中,起主要作用的UGTs亚型;通过构建内质网应激模型细胞及阻断内质网应激通路模型细胞,研究内质网应激对白藜芦醇II相代谢影响的分子机制。本研究的结果将为内质网应激影响药物代谢的相关研究提供理论依据和实验基础,也为白藜芦醇在临床上安全、合理、有效应用提供科学指导。方法:本实验首先建立大鼠肝纤维化所引发的内质网应激动物模型,内质网应激HepG2细胞模型及阻断内质网应激通路的HepG2细胞模型;采用UPLC-PDA法对白藜芦醇及其代谢产物进行定量分析;建立葡萄糖醛酸化代谢反应体外孵育模型,通过水解法求出白藜芦醇的代谢产物与母药之间的转换因子;用Western blot法测定并比较正常组及模型组大鼠,正常及内质网应激细胞模型,阻断内质网应激通路细胞模型内质网应激通路蛋白表达及差异;用Western blot法测定并比较正常组及模型组大鼠,正常及内质网应激细胞模型UGT1A1、UGT1A7、UGT1A9蛋白表达及差异;应用正常及模型组大鼠肝微粒体及正常细胞、内质网应激模型细胞、内质网应激三条通路PERK,IRE1,ATF6通路抑制剂GSK2606414,STF083010,AEBSF诱导的阻断内质网应激通路的HepG2模型细胞裂解液进行白藜芦醇的体外酶代谢反应,分别测定其反应速率,并用GraphPad Prism 5软件对数据进行处理,分析大鼠肝组织和人肝细胞模型中内质网应激对白藜芦醇II相代谢的影响和特点;通过在体外孵育实验中分别加入UGT1A1特异性抑制剂胆红素、UGT1A9特异性抑制剂尼氟酸、UGT1A7和UGT1A9的选择性抑制剂厚朴酚,分析并判断白藜芦醇在大鼠肝组织和人肝细胞模型的II相代谢中起主要作用的UGTs亚型。结果:成功制备了大鼠肝纤维化所引发的内质网应激动物模型,内质网应激HepG2细胞模型、阻断内质网应激通路的HepG2细胞模型;肝微粒体及细胞裂解液体外代谢试验证实,白藜芦醇经大鼠肝微粒体生物转化形成一种葡萄糖醛酸化代谢产物(M1),白藜芦醇经细胞裂解液生物转化形成两种葡萄糖醛酸化代谢产物(M1,M2);Western blot实验结果表明,模型组大鼠肝脏内质网应激被激活,与正常组大鼠相比,模型组大鼠GRP78蛋白表达水平显著增高(p<0.05),PERK磷酸化水平,ATF4表达水平,eIF2α磷酸化水平蛋白表达增高极其显著(p<0.001);肝纤维化引发的内质网应激对大鼠UGTs代谢酶表达有影响,II相药物代谢酶UGT1A1,UGT1A7蛋白表达显著增高(p<0.01);模型组细胞内质网应激通路被激活,GRP78蛋白表达显著增高(p<0.001);同时,PERK磷酸化水平,IRE1,XBP1蛋白表达增高非常显著(p<0.001),ATF6全蛋白表达略有增高,没有统计学意义(p>0.05),核蛋白表达显著增高(p<0.001);细胞核中Nrf2蛋白表达显著增高(p<0.001)。内质网应激可影响UGTs蛋白表达,导致II相药物代谢酶UGT1A1、UGT1A9蛋白表达显著降低(p<0.05)。肝微粒体及细胞裂解液体外代谢结果表明,白藜芦醇在正常组大鼠肝微粒体中的代谢速率高于在模型组大鼠肝微粒体中的代谢速率,但没有显著性差异;在大鼠肝微粒体介导的葡萄糖醛酸化体外孵育实验中,加入UGT1A1特异性抑制剂胆红素,大鼠肝微粒体白藜芦醇葡萄糖醛酸化代谢速率降低显著(p<0.001),加入UGT1A7、UGT1A9选择性性抑制剂厚朴酚,白藜芦醇代谢速率略微降低,但没有显著性差异。白藜芦醇在正常组细胞裂解液介导的体外孵育实验中葡萄糖醛酸化代谢速率明显高于内质网应激模型组(p<0.001);加入胆红素,细胞裂解液中白藜芦醇代谢速率略微降低,没有显著性差异(p>0.05),加入UGT1A9特异性抑制剂尼氟酸,白藜芦醇葡萄糖醛酸化代谢速率显著降低(p<0.001),。内质网应激三条通路分别抑制后,白藜芦醇葡萄糖醛酸化代谢速率有上调的趋势,但无统计学意义。结论:内质网应激的三条激活通路都对白藜芦醇II相药物代谢有影响。在肝纤维化引发的内质网应激模型大鼠中,肝脏的内质网应激可引起II相药物代谢酶UGT1A1、UGT1A7蛋白表达发生变化,且UGT1A1对白藜芦醇的葡萄糖醛酸化代谢发挥重要作用。在内质网应激模型HepG2细胞中,UGT1A1、UGT1A9在内质网应激条件下蛋白表达及活性均发生显著变化并对白藜芦醇葡萄糖醛酸化代谢产生重要影响。UGT1A1、UGT1A7、UGT1A9的蛋白表达变化可能受核受体Nrf2的调控,后续实验将进行进一步的证实。