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乳腺是奶山羊的泌乳器官,在分子水平研究乳腺的调控机理是国内外的研究热点。已有研究表明,miRNA对乳腺的发育和泌乳性能的调控具有重要作用。本实验室在前期通过基因测序发现,miR-3880在奶山羊乳腺发育和泌乳中差异表达,但目前尚未有关miR-3880调控奶山羊乳腺发育和泌乳的试验研究。本研究以奶山羊乳腺上皮细胞为研究对象,利用生物信息学软件预测、RT-qPCR、Western blot分析和双荧光素酶报告载体构建等方法,研究miR-3880在奶山羊乳腺上皮细胞中对靶基因OGR1的调控作用;采用siRNA干扰技术研究靶基因OGR1对奶山羊乳腺上皮细胞的调控作用,以期阐明mi R-3880及其靶基因OGR1对奶山羊乳腺上皮细胞生长及泌乳的调控作用机制,为奶山羊泌乳调控提供试验依据。主要研究结果如下:1.奶山羊乳腺上皮细胞中miR-3880对OGR1基因的调节作用利用靶基因预测软件发现,OGR1的3′UTR区含有miR-3880的靶向结合位点。构建OGR1-3′UTR的双荧光素酶报告载体,分别将miRNA的模拟物(mimics)与报告载体共转到293T细胞中,检测荧光素酶的活性。结果表明,miR-3880 mimics转染组与NC组相比显著抑制了野生型载体的荧光素酶活性,而对突变型载体的荧光素酶活性没有显著影响。通过检测miR-3880对靶基因OGR1表达量的影响,结果发现,mi R-3880在mRNA和蛋白水平上显著抑制靶基因OGR1的表达。由此鉴定OGR1是miR-3880的靶基因。2.OGR1干扰后对奶山羊乳腺上皮细胞凋亡的影响利用siRNA技术干扰OGR1的表达,合成OGR1基因的siRNA模拟物(siOGR1),将siOGR1转染乳腺上皮细胞。结果表明,OGR1干扰后显著抑制细胞的凋亡。同时发现,OGR1干扰后显著抑制Bcl-2和Bax的蛋白表达,上调Bcl-2/Bax的蛋白比值;OGR1干扰后还显著抑制Fas凋亡基因的蛋白表达。3.OGR1干扰后对奶山羊乳腺上皮细胞增殖的影响利用CCK8法检测奶山羊乳腺上皮细胞的增殖。结果表明,与NC组相比,OGR1干扰后显著促进乳腺上皮细胞的增殖。4.OGR1干扰后对乳腺上皮细胞β-酪蛋白和甘油三酯合成的影响利用ELISA法和TG试剂盒法检测乳腺上皮细胞中β-酪蛋白和甘油三酯的合成。结果表明,与NC组相比,OGR1干扰后使乳腺上皮细胞β-酪蛋白和甘油三酯的合成量显著升高。同时采用Western blot检测了AKT和mTOR磷酸蛋白的表达,结果发现,OGR1干扰后显著上调AKT和mTOR的磷酸化水平。综上所述,在奶山羊乳腺上皮细胞中,miR-3880抑制靶基因OGR1的表达;miR-3880通过靶基因OGR1促进乳腺上皮细胞的增殖,并促使AKT和mTOR的磷酸化,激活AKT/mTOR信号通路,增加β-酪蛋白和甘油三酯的合成。