论文部分内容阅读
目的将有促进软骨细胞增值作用的TGF-β1与藻酸钙凝胶有机结合,探索组织工程合适载体,了解TGF-β1对体外培养的藻酸钙凝胶中脂肪干细胞向软骨细胞诱导分化的作用,为关节软骨缺损的修复提供实验依据实验材料6周龄Wister大鼠（250g—300g）,雌雄不限,（中国医科大学实验动物中心提供）;高糖DMEM培养基（Gibco,美国）;Ⅰ型胶原酶（Sigma,美国）;鼠尾胶原（杭州生友生物技术有限公司）;地塞米松,ITS+,牛血清白蛋白,维生素C（Sigma,美国）,转化生长因子β1（PeproTech,美国）;藻酸钙凝胶,Ⅱ型胶原多克隆抗体,SABC免疫组化试剂盒（武汉博士德生物科技有限公司）;SRK LYOVAC GT2-9冷冻干燥机（德国）。实验方法无菌条件下取双腹股沟脂肪组织约10毫升。充分剪碎约1立方毫米,0.1%的胶原酶和0.25%胰酶,37℃振荡消化15min,基础培养基终止消化,离心,弃上清,再用基础培养基重悬细胞,接种于培养瓶中,置于37℃、5%CO2培养箱中,饱和湿度条件下培养。20小时后首次换液,以后每三天换液一次,待细胞生长至接近融合时传代,7-10天达到80～90%融合时首次传代。取传到第4代的脂肪干细胞,消化,基础培养基重悬。藻酸钙凝胶（Matrixkit）置于12孔板内,完全培养基清洗3次;按每块5*106/ml将细胞悬液用无菌注射器滴于海藻酸钙凝胶表面的凹陷中每孔加10%FBS-DMEM完全培养基于37℃,5%CO2条件下培养2d。24小时将基础培养基半量换成诱导培养基（转化生长因子β1 50mg/L）,再过24小时后全量换为诱导培养基,此后每3天换液一次。实验结果1.细胞增殖检测:接种细胞后增殖,随着时间延长MTT值升高。2、大体及显微镜观察接种细胞悬液后,细胞呈圆形,类圆形附于载体上,随着时间的延长,细胞逐渐布满整个空隙,并有基质分泌,细胞被包埋于其分泌的基质中,细胞与细胞之间,细胞与载体之间紧密结合3、HE染色培养3周后HE染色可见大量的细胞外基质产生,细胞与细胞间以及细胞与载体间相互间紧密联结。4、电镜观察藻酸钙凝胶有网状的孔隙,利于细胞生长所需物质与能量交换及代谢产物排泄,细胞黏附于藻酸钙凝胶上,细胞伸展,生长良好,细胞被包埋在其分泌的基质中,细胞与细胞之间紧密结合,细胞与载体间紧密结合。5、Ⅱ型胶原免疫组化检测免疫组化显示,载体复合物Ⅱ型胶原呈阳性。结论1、藻酸钙凝胶对细胞的培养是三维培养,藻酸钙凝胶表面积大,内部孔隙多,适合于细胞黏附和进行营养交换,有利于细胞附着,生长,增值。2、TGF-β1不仅仅在软骨细胞体外培养过程中有促进作用,在藻酸钙凝胶载体上同样具有促脂肪干细胞向软骨细胞分化的作用