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甲型流感病毒（Influenza Avirus）是分节段的负义单链RNA囊膜病毒，属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae family），可以感染人类以及马、牛、猪、狗、鸡和鸟等畜禽类。高致病性禽流感(highly pathogenic avian influenza，HPAI)H5N1病毒是甲型流感病毒的一个亚型，主要在鸟类中传播，可以由鸟类传播给人，有些证据证明存在有限的人传人。因为该病毒亚型感染人致死率高(大约60％)，且研究表明最少5个氨基酸的突变可以使其在人与人之间有效传播，因此高致病性禽流感病毒存在大流行的可能，严重威胁人类的生命健康。针对高致病性禽流感病毒H5N1的疫苗对于预防H5N1的大流行非常有必要，目前已经有很多公司和研究组在研发各种类型的H5N1疫苗。病毒样颗粒(virus-like particles，VLP)疫苗是一种新型的重组蛋白疫苗，因为它能够有效地刺激机体产生体液和细胞免疫，而且具有安全、成本低、研发生产速度快等优势，成为目前流感疫苗研究中一种重要的候选疫苗形式。我们利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达流感病毒HA，NA和M1蛋白或者HA，M1和M2蛋白，研究表明流感病毒蛋白在昆虫细胞中的共表达可以形成VLP。动物实验表明，流感病毒VLP有较好的免疫原性，可以有效地刺激小鼠产生针对VLP的特异性抗体。 甲型流感病毒H7N9是禽流感病毒的一个亚型，一般在鸟类中传播。2013年，在中国出现人感染H7N9病例，并引起严重的临床症状，引起了人们的广泛关注。为研究用于预防H7N9大流行的疫苗，我们构建了一株能够在Sf9细胞中共表达H7N9病毒的HA，NA和M1蛋白的重组杆状病毒，用重组杆状病毒感染Sf9细胞成功表达相关流感蛋白并组装形成VLP。 本论文共分四章: 第一章:文献综述。病毒样颗粒疫苗是一种新型的疫苗形式，已经经过了近30年的研究历史，本章对病毒样颗粒的研究历史、现状、使用的表达系统，以及作为疫苗的有优缺点做了综述，并对流感病毒疫苗的发展做了简要介绍。 第二章:流感病毒H5N1 VLP的构建。我们利用杆状病毒表达系统构建了两株表达流感病毒囊膜蛋白和基质蛋白的重组杆状病毒，感染Sf9细胞形成流感病毒VLP。通过SDS-PAGE、Western blotting等检测到流感蛋白在细胞中的表达;感染细胞切片在透射电镜下可以观察到VLP颗粒;感染细胞上清经过蔗糖密度梯度离心和负染电镜观察可以看到流感病毒VLP的形态，其形态与天然病毒很相似;血凝试验表明从细胞中纯化得到的VLP有较高的血凝活性。 第三章:H5N1 VLP免疫原性研究。我们用流感病毒H5N1 VLP粗纯化样品免疫小鼠，免疫小鼠血清可以检测到较高滴度的VLP特异性的抗体，血清对H5N1 VLP具有血凝抑制效果，但是对H5N1病毒没有血凝抑制效果。 第四章:H7N9 VLP的构建。利用杆状病毒表达系统在Sf9细胞中共表达流感病毒H7N9的HA、NA和M1蛋白，并成功组装形成VLP。我们对外源蛋白的表达做了检测，表明流感病毒蛋白在Sf9细胞中成功表达。通过初步纯化和负染电镜的观察，我们观察到了H7N9的VLP，其形态与流感病毒的结构比较相似，，血凝和血凝抑制试验显示H7N9 VLP有较高的血凝效价，且其血凝效果能够被H7特异性的抗体有效抑制，说明H7N9 HA蛋白在VLP表明正确组装。