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在无血清共培养条件下,为研究脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs)对奶牛乳腺上皮细胞(Bovine Mammary Gland Epithelial Cells,BMECs)增殖、凋亡、及乳脂、乳蛋白合成的影响,揭示非外源性细胞因子对BMECs泌乳调控的具体作用机制。本试验分为三个部分:第一部分,以UC-MSCs和BMECs为研究对象,纯化扩增选取生长状态最佳的P(Passage,P)5代UC-MSCs和P8代BMECs,将2种细胞以直接和间接接触两种共培养方式作为试验组,直接接触是按照UC-MSCs:BMECs分别为2:1、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10的浓度梯度混合共培养,间接接触则是提取UC-MSCs的上清液作为条件培养基重悬BMECs,对照组为UC-MSCs和BMECs单培养组,于0、4、8、12、24、36、48、60、72 h时观察各组细胞的生长变化,采用细胞增殖与活性检测试剂盒CCK-8法检测各组细胞增殖情况,并结合细胞形态学观察筛选出UC-MSCs和BMECs最佳共培养条件。第二部分,以最佳共培养比例和时间为基准,建立UC-MSCs和BMECs(1:2)共培养试验组,对比单独培养的UC-MSCs和BMECs,48 h后,ELISA法检测各组上清中IGF-I分泌情况;利用Transwell~?小室将UC-MSCs和BMECs上下双层共培养,于不同时间点提取各组RNA,实时荧光定量PCR检测细胞中IGF-ⅠR、IGF-ⅠmRNA的表达。第三部分,在Transwell~?小室共培养验证IGF-I最佳分泌条件的基础上,以BMECs单纯培养为对照,分别采用IGF-ⅠR抑制剂AG1024、JAK2信号特异性阻断剂AG490和PI-3K信号特异性阻断剂LY294002处理细胞,观察处理前后各组细胞生长情况,采用Annexin V-FITC/PI双参数法和流式细胞仪检测细胞凋亡,测定上清中IGF-Ⅰ和CSN2、CSN3、TG含量变化,RT-qPCR检测细胞信号通路相关基因PI-3K、AKT、mTOR、JAK2、STAT5、ELF5的表达丰度,细胞凋亡基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA相对定量值,及乳脂、乳蛋白合成关键基因ACACA、FASN、SREBP1及CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度。结果:第一部分,优化了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,结果显示,48 h,条件培养基BMECs组光密度(Optical density,OD)值显著高于对照组(P<0.05),而1:2浓度组极显著高于对照组(P<0.01),显著高于其他各组(P<0.05);第二部分,Transwell~?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的相互作用,结果显示,48 h,两种共培养方案IGF-Ⅰ、IGF-ⅠR mRNA表达值显著或极显著高于单培养组(P<0.05,P<0.01),共培养组IGF-Ⅰ浓度显著高于UC-MSCs组(P<0.05),极显著高于BMECs组(P<0.01),BMECs/UC-MSCs组显著高于UC-MSCs/BMECs组(P<0.05);第三部分,证实了UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂乳蛋白的影响及可能作用途径,结果显示,试验组的凋亡率极显著低于其他各组(P<0.01),试验组较对照组Bcl-2 mRNA表达丰度极显著上调(P<0.01)、Caspase-3、Bax mRNA表达显著下调(P<0.05),AG1024、LY294002和AG490处理后,上调了各组细胞凋亡率和Bax、Caspase-3 mRNA表达丰度,下调了Bcl-2 mRNA表达丰度,均具有统计学意义;乳脂、乳蛋白合成的结果显示,试验组各项指标均显著或极显著高于对照组(P<0.05,P<0.01),AG1024处理对IGF-Ⅰ具有极显著抑制效果(P<0.01),显著和极显著降低TG、CSN2、CSN3含量及各基因相对表达丰度(P<0.05,P<0.01),AG490处理显著降低CSN2、CSN3 mRNA相对表达丰度(P<0.05),但对ACACA、FASN、SREBP1 mRNA的表达无显著影响(P>0.05),LY294002处理抑制了PI-3K(P<0.01)、AKT、mTOR(P<0.05)mRNA的表达,显著降低了TG、CSN2、CSN3含量及各基因表达(P<0.05),AG1024和AG490共同处理时乳脂合成关键基因表达变化较AG1024单独处理差异不显著(P>0.05),AG1024和LY294002共同处理显著下调了CSN2、CSN3 mRNA的表达(P<0.05),极显著降低了其他各指标(P<0.01)。综上所述,本研究建立了UC-MSCs和BMECs最适共培养条件,且利用Transwell~?小室明确了UC-MSCs和BMECs之间的作用,发现UC-MSCs对BMECs中IGF-Ⅰ及其受体相应基因的表达起促进作用,IGF-I参与UC-MSCs对BMECs凋亡、乳脂及乳蛋白合成的调节作用,PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路是IGF-I调控BMECs凋亡、泌乳功能的共同通路,但JAK2/STAT5信号通路不参与UC-MSCs对BMECs乳脂合成的调控,因此可以说UC-MSCs通过IGF-I介导PI-3K/AKT/mTOR和JAK2/STAT5信号通路协同抑制BMECs凋亡,提高其存活率,从而促进BMECs乳脂、乳蛋白合成,进而调控BMECs泌乳性能,不仅弥补了BMECs自身IGF-I分泌不足的缺陷,也为进一步探究内源性IGF-Ⅰ对BMECs生物学功能的调节作用奠定理论基础。