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目的三磷酸腺苷(ATP)是一种复杂的有机化学物质,它参与了生命体的许多重要活动,如肌肉收缩,神经冲动传导和化学合成1。ATP是给生命体能量供给的最小单位,它几乎参与了生命活动的每个流程。细胞是生命组成的最小单位,ATP在细胞内有较高的浓度,以此保证各项细胞活动的进行,而在细胞外浓度较低,在细胞内外有明显的浓度差异。我们发现了一个能响应肿瘤胞内胞外ATP浓度差的适配体(Aptmer)结构,并设计了其与相应的cDNA,两个可以组成富含GC片段的双螺旋(DNA)结构,丰富的GC片段可以嵌入阿霉素(DOX),使该双螺旋结构能在响应ATP浓度差的同时递送DOX进入胞内。为了更好的递送这一双螺旋结构,我们合成了聚乙烯二胺(PEI)月桂酸(LA)聚合物胶束(PEI-LA),使聚合物粒径大小在200nm以内,具有EPR效应的被动靶向性,以其作为载体递送由ATP适配体组成的载有阿霉素的双螺旋结构。同时在载药胶束外包覆寡聚透明质酸(Oligo Hyaluronic Acid,OHA)层,以期赋予载药胶束主动靶向功能,同时减小细胞毒性,改善血液相容性。这一结构能够具有被动靶向性,可以在肿瘤部位富集,同时可以主动靶向到肿瘤细胞,且具有肿瘤微环境敏感性,响应细胞内外ATP浓度差,实现药物的有效控释。方法(1)将ATP适配体与其相对应的cDNA混合,组成具有ATP敏感型的双螺旋结构。将其与一定比例DOX溶液混合,组成装载DOX的ATP敏感型双螺旋结构。将其与不同浓度ATP溶液混合,观察其响应情况。(2)合成PEI-LA聚合物胶束,通过1H-NMR表征其结构,测定其临界胶束浓度、粒径电位,通过电子显微镜观察其形态。(3)以PEI-LA聚合物胶束为载体,与装载DOX的ATP敏感型双螺旋结构共孵育,制成载药胶束(DOX/PEI-LA)。将其与OHA溶液混合,制备成具有主动靶向性的聚合物载药胶束(OHA/DOX/PEI-LA),并对载药胶束的相关性质进行考察。(4)通过琼脂糖凝胶电泳考察聚合物胶束对载药ATP敏感型双螺旋结构的吸附情况。(5)考察载药胶束在不同胞内ATP浓度的环境中的释药情况。(6)考察细胞对载药胶束的摄取情况,以及在进入细胞后的分布状况。考察载药胶束的细胞毒性,及给药后细胞凋亡情况。(7)通过3D肿瘤球模型考察载药胶束的穿透性。(8)建立皮下和原位肺癌模型,以Dir标记聚合物胶束,利用小动物活体成像技术考察聚合物胶束的体内分布情况。(9)构建裸鼠原位肺癌以及皮下肿瘤模型,分别给予生理盐水,DOX,寡居透明质酸包覆的载药胶束,没有寡居透明质酸包覆的载药胶束进行治疗,通过小动物活体成像观察原位肺癌模型荧光变化以及皮下肿瘤大小变化考察药物疗效,监测小鼠体重变化,评价小鼠生存质量。最后对实验动物进行解剖,取出组织进行切片染色,观察肿瘤坏死情况。结果(1)构架形成了具有ATP敏感型的可载DOX双螺旋结构,通过检测DOX荧光强弱,确定DOX与ATP适配体比例为3:1时达到最佳装载比例。不断增加ATP浓度,DOX荧光逐渐增强,该结构具有ATP敏感性。(2)成功合成PEI-LA,并用1H-NMR进行表征,聚合物已成功制备。测定其临界胶束浓度,判定该聚合物为胶束。平均粒径为(188.6±3.86nm),PDI为0.280。在包覆OHA后,平均粒径为(152.1±0.5)nm,PDI为0.110。通过透射电镜观察其形态,胶束外观圆整,分布均匀,而在包覆OHA层后,可在边缘看到明显外层。(3)通过MTT试验,吸附有ATP敏感双螺旋适配体但是没有包载DOX的聚合物胶束对于细胞毒性较小,安全性较好。(4)ATP适配体双螺旋与PEI-LA胶束比例为60:1时,达到最佳的吸附比例。(5)在细胞置于4℃及37℃载药胶束在ATP丰富的环境中相较于ATP受抑制的环境,DOX得到更多的释放,说明吸附了 ATP敏感双螺旋适配体的载药胶束确实具有ATP浓度响应性。(6)用流式细胞术,激光共聚焦显微镜考察细胞对载药胶束的摄取情况及亚细胞定位情况,结果表明OHA的包覆可以提高载体靶向性,增加摄取,并有溶酶体逃逸现象。包覆了 OHA层的载药胶束相较于没有包覆以及DOX原料药,有更强的细胞毒性。同时考察细胞对于DOX的摄取情况,包覆OHA的载药胶束组摄取情况最好,可以较快的进入细胞核中。细胞凋亡试验显示给予寡居透明质酸包覆的载药胶束可以加快细胞进入凋亡程序。(7)3D肿瘤球切片可观察到包覆OHA的载药胶束穿透性较强,DOX最弱。(8)小动物活体成像试验显示胶束对皮下和原位肺癌都具有较好的靶向性。(9)接种有原位肺癌的裸鼠在给药后可见肿瘤部位生物发光变换,包覆有OHA的载药胶束生物发光明显强度变弱,区域减小,相较于其他组药效最好。同时,小鼠体重没有明显减少,HE染色组织切片没有明显器官损伤。结论ATP敏感型的载药胶束可以快速响应肿瘤细胞内外的ATP浓度差异,达到靶向释药的效果,同时PEI-LA胶束可以吸附ATP适配体双螺旋,成为递送基因进入细胞的载体,而OHA的包覆可以减小载体毒性,使其具有主动靶向性。研究表明,OHA包覆的装载DOX的ATP敏感型聚合物胶束具有良好的靶向性,可以作为有潜力的新型敏感型纳米制剂。