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背景与目的:沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis,CT）感染可引起沙眼、输卵管炎及不孕等多种疾病,还能促进HPV多个亚型混合感染,增加宫颈癌的发生率。此外,生殖道CT感染可导致机体阴道菌群结构发生显著变化,这种改变是否会反作用于CT感染的发生与发展目前还尚未清楚。近年来,女性不孕的发病率呈逐年上升趋势,CT作为不孕症的重要病原体,关于不孕女性群体CT感染的流行病学的相关资料甚少。因此,本研究首先通过收集5006例不孕女性、健康体检女性及妇科门诊就诊女性患者临床样本,研究不孕女性CT感染状况及其基因型分布、CT与HPV共感染特征及其与宫颈上皮内瘤变的相关性;然后应用16S rRNA测序等手段分析CT阴性、CT感染不孕女性患者及其治疗后阴道菌群的多样性;随后从细胞水平探讨不同组间CT感染患者阴道内差异优势菌及其代谢产物对CT感染力的影响;最后通过建立小鼠生殖道感染模型,从动物水平进一步探讨组间差异优势菌对衣原体感染后小鼠下生殖道、肠道衣原体清除的影响,以及在小鼠生殖系统、肠道病理损伤及其诱导宿主免疫应答中的作用。本研究从人群、细胞、动物三个水平对不孕女性CT感染的流行病学、阴道菌群变化及其在衣原体生殖道感染中的作用进行了系统地研究,为明确不孕女性CT感染的分子流行病学特征、微生态调节干预治疗CT感染以及丰富CT的致病机制提供依据。方法:1.应用PCR扩增样本中CT质粒ORF2基因片段,对5006例临床样本进行CT筛查,再利用巢式PCR扩增CT DNA筛查阳性样本Omp1 VS1～VS2基因片段,扩增产物经测序后,根据Omp1 VS1～VS2基因序列的多态性进行CT分型。2.应用导流杂交与PCR扩增相结合技术,对21种HPV基因型,包括 HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 高危型 14 种、HPV6、11、42、43、44,CP8304（81）低危型6种及疑似高危型HPV53进行基因分型。3.以666例不孕女性患者为病例组,年龄为匹配因素按1:1比例进行病例对照匹配,分析体检中心、生殖中心及妇科门诊女性患者CT、HPV及其共感染率;以236例CT 阳性患者或778例HPV 阳性患者为病例组,年龄及临床科室为匹配因素进行1:1的病例对照匹配,分析CT、HPV感染率的相关性。4.应用 NEB Next（?）UltraTM DNA Library Prep 构建 DNA 文库后,采用二代高通量Illumina Nova测序平台对健康CT阴性、不孕CT阴性、不孕CT 阳性女性患者及其治疗后阴道分泌物进行细菌基因组16S rRNA扩增子测序,联合运用QIIME、MUSCLE、SILVA132、Cytoscape和Graphviz等软件对各组阴道菌群Alpha多样性、Beta多样性、NMDS、UPGMA和Network关联等进行分析,并利用qRT-PCR对不孕CT 阳性女性患者阴道分泌物中15种差异优势菌属进行验证。5.应用超高效液相色谱串联质谱仪（UPLC-MS/MS）检测乳酸杆菌代谢产物中琥珀酰丙酮、非衍生化多种氨基酸及肉碱水平;乳酸酶电极法检测其乳酸水平;分光光度法检测其乳酸同分异构体L（+）乳酸和D（-）乳酸水平。6.分别以惰性、格氏、卷曲、詹氏、粘膜、罗伊及唾液乳酸杆菌代谢产物,或0～20 mM不同浓度的L（+）乳酸和D（-）乳酸在不同pH条件下刺激CT E型菌株或HeLa细胞,应用间接免疫荧光法（IFA）检测不同条件下衣原体包涵体形成单位（IFU）,分析其剂量及酸度效应关系;利用台盼蓝染色法检测其对HeLa细胞活性的影响。7.分别在惰性乳酸杆菌代谢产物中加入终浓度10 mM的L（+）乳酸、D（-）乳酸,以无机HCl为平行对照刺激CT,应用IFA检测不同条件下衣原体IFU,分析乳酸同分异构体对CT拮抗作用的特异性。8.构建Cm生殖道感染小鼠模型,分别以2×109 CFU卷曲乳酸杆菌、罗伊乳酸杆菌、惰性乳酸杆菌及三种酸杆菌1:1:1混合物在Cm感染后接种小鼠生殖道进行干预,并通过qRT-PCR对乳酸杆菌干预是否成功进行验证。9.将35只4～6周龄雌性BALB/c小鼠随机分为SPG、Cm、Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix 及 Cm+Mix-P 组,每隔 3～7 d,收集小鼠阴道拭子和肛拭子样本,应用IFA法检测阴道拭子和肛拭子脱落细胞中不同时期衣原体的排菌量;ELISA法检测各时期阴道拭子中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6及IL-10细胞因子水平;10.Cm感染后80 d,分离小鼠生殖系统、肠道组织,H&E染色后评估小鼠输卵管、子宫角、大肠及小肠组织病理损伤情况;应用ELISA法检测血清Ig G、Ig G1及Ig G2a亚类抗体水平;取小鼠脾细胞,应用流式细胞术检测CD4+、CD8+细胞水平,并以1 × l06 IFU经UV灭活的Cm刺激小鼠脾细胞,分别应用流式细胞术检测脾细胞内CD8+/IFN-γ、CD4+/IFN-γ、CD8+/IL-4及CD4+/IL-4 水平,ELISA 法检测细胞上清 TNF-α、IFN-γ 及 IL-10细胞因子水平。结果:1.本研究发现CT总体感染率为4.7%（236/5006）,不孕女性CT感染率为3.5%（23/666）,体检中心及妇科门诊就诊女性患者CT 感染率分别为 3.8%（38/1006）、5.2%（175/3334）,三组间比较差异有统计学意义（P=0.043）;CT基因型流行以E型（30.1%,69/229）、F 型（23.1%,53/229）和 J 型（17.9%,41/229）为主,CT和HPV基因型分布无显著相关性（r=0.08,P=0.67）。2.青年女性（≤25岁）CT感染率显著高于>25岁年龄组女性（10.4%VS 4.0%,P<0.001）,年龄和HPV感染是CT感染的危险因素（OR=0.496,P<0.001;OR=1.710,P<0.001）;CT 感染是女性宫颈低级别病变的危险因素（OR=3.25,P=0.018）,HPV感染是女性宫颈低级别、高级别病变或癌的危险因素（OR=6.89,P<0.001;OR=15.86,P<0.001）。3.通过Illumina Nova测序平台对CT阴性、CT感染患者及其治疗后等25例临床样本进行测序,共获得1,949,887条原始序列,经过质控筛选后获得1,639,766条高质量的序列,平均每个样品65,591条序列可用于后续数据分析,并且各样本Goods overage指数值均超过98%,提示测序深度合理,覆盖了样品中98%以上的细菌种系型,可以真实地反映样品中所含微生物的情况。4.不孕女性CT 阳性组衣原体门和放线菌门的相对丰度均高于不孕CT阴性组及其他组（P<0.05）,而厚壁菌门和变形菌门的相对丰度低于不孕CT阴性组（P<0.01）;不孕女性CT 阳性组乳酸杆菌属的相对丰度显著低于不孕CT阴性组（P<0.01）,而经治疗后患者阴道内乳酸杆菌水平得到不同程度恢复,其相对丰度显著高于不孕女性CT 阳性组（P<0.01）。5.本批次CT和Cm在不同稀释度下的平均浓度分别为3.39×108 IFU/mL、5.15×108 IFU/mL;惰性、格氏、卷曲、詹氏、粘膜、罗伊及唾液乳酸杆菌代谢产物中乳酸浓度均显著高于MRS对照2～20倍（P<0.001）,并显著高于琥珀酰丙酮等其他代谢产物（P<0.01）,提示乳酸杆菌代谢产物均以乳酸为主要成分。6.本研究中7种乳酸杆菌代谢产物使CT感染力下降30%～90%,该拮抗作用呈剂量、时间及pH依赖模式,其中卷曲乳酸杆菌代谢产物作用较强,可使CT感染力下降约85%（P<0.01）、惰性乳酸杆菌代谢产物相对较弱（下降约45%）,另外,各乳酸杆菌代谢产物pH调节到7时,其对CT感染力的拮抗作用均显著下降（P<0.01）。7.卷曲乳酸杆菌代谢产物中D（-）乳酸浓度显著高于其在惰性乳酸杆菌代谢产物中的含量（9.8 mM VS 0.6 mM,P<0.01）,惰性乳酸杆菌代谢产物加入终浓度为10 mM D（-）乳酸较加入L（+）乳酸或单独惰性乳酸杆菌代谢产物其拮抗作用均显著增强（P<0.001）;D（-）乳酸对CT感染力的拮抗作用显著高于L（+）乳酸或无机HCl（P<0.01）,D（-）乳酸对CT感染力的拮抗作用呈剂量、pH依赖模式,提示D（-）乳酸是抑制CT感染的重要成分,合适的pH在D（-）乳酸拮抗CT感染的过程中起到重要作用,乳酸杆菌代谢产物中可能还有其他成分对CT感染的拮抗具有协同作用。8.Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix 及 Cm+Mix-P组小鼠生殖道感染Cm输卵管积水的发生率、肠道衣原体清除速度较Cm组无明显改变（P>0.05）;Cm+Mix组小鼠下生殖道衣原体带菌量与Cm+Mix-P组比较差异无显著性差异（P>0.05）,但Cm+Mix与Cm+LC组下生殖道衣原体带菌量较低Cm组显著减少（P<0.05）;Cm+Mix组小鼠输卵管扩张及炎症程度评分均低于Cm组（P<0.05）;所有实验组除个别小鼠小肠、大肠出现少量淋巴细胞和浆细胞外,其他均无典型炎症反应,各组小鼠小肠、大肠炎症评分无显著性差异（P>0.05）。9.Cm、Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix 及 Cm+Mix-P组 TNF-α、IFN-γ、IL-1β及IL-6水平较SPG对照组均显著升高（P<0.05）,而IL-10水平较SPG组无显著差异（P>0.05）;此外,Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix及Cm+Mix-P组小鼠阴道分泌物中TNF-α、IFN-γ 及 IL-1β 水平显著低于 Cm 组（P<0.01）,但 IL-6水平较Cm组无显著差异（P>0.05）。10.Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix 及 Cm+Mix-P 组小鼠均产生较高水平的衣原体特异性Ig G、Ig G1及Ig G2a,且Ig G2a和Ig G1比值均>1,但与Cm组各种亚类的抗体水平比较无显著性差异（P>0.05）;Cm、Cm+Mix及Cm+Mix-P组小鼠脾细胞CD4+/IFN-γ和CD8+/IFN-γ细胞水平显著高于SPG组（P<0.05）,而 Cm、Cm+LC、Cm+LR、Cm+LN、Cm+Mix 及Cm+Mix-P组CD8+/IL-4和CD4+/IL-4细胞水平与SPG组比较均无统计学差异（P>0.05）。结论:1.不孕青年女性生殖道CT感染率较高;CT基因型流行以E、F、J型为主,与HPV基因型分布无显著相关;年龄和HPV感染是CT感染的危险因素,CT和HPV与不同程度的宫颈上皮内瘤变存在相关。2.不孕女性CT感染患者阴道菌群以惰性乳酸杆菌为主要成分,乳酸杆菌属相对丰度显著减少,经治疗后其阴道内乳酸杆菌水平得到不同程度的恢复。3.乳酸杆菌代谢产物对CT感染力有不同程度的拮抗作用,其中D（-）乳酸是发挥拮抗作用的重要成分,pH是其拮抗CT感染的重要因素。4.混合乳酸杆菌干预可以促进下生殖道衣原体清除、减轻其输卵管扩张和炎症反应;然而单独或混合乳酸杆菌干预对小鼠生殖道感染Cm输卵管积水发生率、肠道衣原体清除及其诱导细胞免疫应答的类型均无明显改变。