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对甲醇营养型毕赤酵母表达系统的研究和应用有近20年的历史。大量文献资料表明,许多外源基因可以在毕赤酵母中成功表达,但表达水平有时相差很大。基因表达的影响因素较多。迄今为止,人们尚不能在实验前对目的基因的表达水平进行有效评估。在本文中,我们分析了外源基因3末端二级结构与表达水平之间的关系;在此基础上,建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。而且以 NGAL(Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin)为目的基因,应用这一模型对 NGAL基因是否能在毕赤酵母中高效表达进行了预测和实验验证,初步证明了这一数学模型的准确性。 内容与方法: 1.收集了40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。获取下列基本信息:基因名称、表达量、目的基因插入载体的酶切位点、基因扩增引物等,拟定以表达量100 mg/L为界限,按此界限将40例目的基因表达水平分为高/低两组。 2.从NCBI获取相关目的基因的核酸序列,与基因的3端扩增引物进行核酸序列比对,确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列,据此对每个数据构建200bp的片段。 3.从上述每个基因的200bp片段,截取9,000个区间,截取方式为[X, Y], X和Y在200bp片段的范围为1≤X≤100,和111≤Y≤200。 4.使用RNAfold软件计算每个区间最低自由能,构建最低自由能矩阵。 5.使用 Tclass分类程序和目的基因的分类信息对最低自由能矩阵进行 t检验及判别分析,得到理论上可以判别表达水平高低的区间组合,随后重复200次按75％比例随机将所有40例目的基因的自由能数据分为训练集和检验集,通过分类稳定性分析来筛选最佳判别区间组合。 6.利用获得的最佳判别区间组合建立判别函数,将40个数据按75%比例随机分成两组,并利用多数组建立判别函数,此过程重复1000次,最终得到1000个判别函数。 7.构建NGAL基因的200bp片段,利用RNAfold软件计算上述步骤“6”结果中最佳判别区间的最低自由能。 8.利用上述1,000个判别函数计算NGAL高效表达的可能性。 9.扩增NGAL去除信号肽序列的编码区,构建pPIC9-NGAL表达载体,将表达载体线性化,LiCl法转化到毕赤酵母GS115株中,铺 RDB平板,筛选单克隆。 10.取单克隆,PCR法鉴定整合到酵母基因组DNA中的重组子。 11.置酵母单克隆于液体培养基中,进行诱导表达。 12.收集培养基上清,SDS-PAGE电泳后,进行western blotting检测,确定是否有NGAL蛋白的表达。 13.以来自原核E.coli表达的NGAL蛋白作参照,选择高表达重组克隆的上清,进行倍比稀释,SDS-PAGE电泳后,进行western blotting检测,评估NGAL在酵母中的表达水平。 结果: 1.分析最低自由能矩阵,获得了最佳组合的6个判别区间;构建了1,000个判别函数。 2.利用判别函数分析,预测NGAL高效表达的可能性为0.512。 3.构建的pPIC9-NGAL表达载体经线性化后转化毕赤酵母,经PCR鉴定获得了12个重组酵母克隆株。 4.将上述重组酵母克隆株进行扩大培养,收获培养基上清,进行western blotting检测,发现这些克隆株NGAL蛋白的表达量很大,高达128mg/L以上。初步验证了pPIC9载体在酵母中高效表达数学模型的准确性。 结论: 1.外源基因的3末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比较重要的因素。在此基础上,建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达的数学模型。 2.实现了NGAL基因在酵母中的高效表达,初步验证了这一数学模型的准确性。