【摘 要】
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喹诺酮类(Quinolones, QNs)药物是一类具有抗菌谱广、活性极高、生物利用度高、价格便宜、耐药突变概率低且极少产生交叉耐药性的人工合成抗生素,由于作用明显且优点诸多而被
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喹诺酮类(Quinolones, QNs)药物是一类具有抗菌谱广、活性极高、生物利用度高、价格便宜、耐药突变概率低且极少产生交叉耐药性的人工合成抗生素,由于作用明显且优点诸多而被广泛应用于临床。研究发现,QNs有可能使幼龄动物(尤其是犬)表现出跛行、关节损伤等软骨毒性症状,其临床应用也因此被局限。目前,QNs导致的软骨毒性还没有被阐明。研究发现死亡受体途径中的TNFR信号通路相关基因在QNs作用于软骨细胞早期均有不同程度的表达,其是否参与QNs诱导的软骨细胞凋亡,需进一步研究证实。本实验采用siRNA阻断软骨细胞TNFR1基因表达探究TNFR信号通路是否参与了QNs诱导软骨细胞的早期凋亡。取幼龄犬软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞,培养至第3代。分别使用100μg/mL麻保沙星和氧氟沙星处理软骨细胞2h、8h和24h。采用MTT比色法及流式细胞检测技术检测软骨细胞在各时间点的活性及凋亡率；实时荧光定量PCR法检测软骨细胞TNFR信号通路中关键因子TNF-α TNFR1、TRADD、FADD和Caspase-8的各时间点mRNA表达水平；Western Blot法检测标志性蛋白TNF-a和TNFR1在各时间点的表达水平；根据实时荧光定量PCR结果,采用siRNA干扰技术沉默TNFR1基因,检测麻保沙星和氧氟沙星处理软骨细胞8h软骨细胞凋亡率和TNFR1下游分子基因表达水平的变化。在24h内,两种药物处理软骨细胞凋亡率显著性升高(p<0.01),细胞活性显著下降(p<0.01),且呈时间依赖关系；TNFR信号通路相关因子TNF-α、 TNFR1、TRADD、FADD和Caspase-8的mRNA水平多数于8h达到高峰；死亡受体标志性蛋白[NF-a以及TNFR1表达水平在2-24h显著增加(p<0.01); TNFR1基因沉默能够显著抑制(p<0.01)麻保沙星或氧氟沙星诱导的软骨细胞凋亡率,降低下游相关信号因子表达量。本实验研究了QNs处理犬软骨细胞24h内死亡受体通路各相关因子的表达,并通过siRNA干扰技术首次证实TNFR信号通路能够在氧氟沙星和麻保沙星的诱导下被激活并对凋亡起主导作用。
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