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哺乳动物神经元凋亡的分子机制越来越受人们的关注，因为神经元的这种死亡形式对神经系统的正常发育起着举足重轻的作用，异常的神经元凋亡是人类神经退行性疾病的病理机制。现在科学研究目标是确定神经元死亡机制的关键组分，以及细胞内信号转导途径对细胞死亡程序的调控。
小脑颗粒神经元(CGNs)是哺乳动物脑中丰富的中枢神经元。体外培养CGNs时，胞外25 mmol/LKCl(25K)可使神经元处于去极化状态，维持小脑颗粒神经元的分化、成熟和存活，而去血清、复极化浓度的KCl(5 mmol/L，5K)培养基可诱导分化成熟的小脑颗粒神经元凋亡。由于小脑颗粒神经元来源丰富、体外培养的同质性高，所以此凋亡模型已被广泛应用于中枢神经元凋亡机制的研究。
研究目的：
1．利用小分子RNA干扰技术特异地沉默内源性c-jun，检测其对小脑颗粒神经元凋亡的影响作用；
2．为研究c-Jun在凋亡中的作用机制提供新的工具。
实验方法及结果：
1．在撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，JNK/c-Jun通路激活体外培养7天的小脑颗粒神经元，从含去极化浓度钾离子(25 mmol/LKCl，25K)的培养基中转移至低钾培养基(5 mmol/LKCl，5K)中诱导凋亡。利用 Western blot检测磷酸化JNK、磷酸化c-Jun和c-Jml的水平；利用RT-PCR检测c-jun mRNA水平；利用报道基因检测c-jun promoter活性。结果显示：撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，JNK、c-Jun磷酸化水平增加；用JNK抑制剂SP600125(10 μmol/L)和MLK抑制剂CEPl1004(2μmol/L)，能够抑制c-Jun的磷酸化；并且撤钾时，c-jun的mRNA水平、蛋白水平、promoter活性都升高。以上结果表明：撤钾诱导小脑颗粒神经元凋亡时，JNK、c-Jun活性增强，并且c-Jun活性增强是由JNK介导的；撤钾时，c-jun基因的转录增强，c-jun的mRNA水平和蛋白水平都升高。
2．JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路用JNK抑制剂SP600125(10μmol/L)、MLK抑制剂CEPl1004(2μmol/L)抑制JNK活性，及用c-jun负显性腺病毒Ad-△169抑制c-Jun活性，Hoechst 33258进行核染色统计凋亡率，观察对小脑颗粒神经元凋亡的影响。结果显示：SP600125、CEPl1004和Ad-△169都能够保护性抑制撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。以上结果表明：JNK/c-Jun是神经元凋亡的关键通路。
3．c-jun siRNA保护小脑颗粒神经元运用小分子干扰的设计软件及其原则，设计干扰序列，通过BLAST，目的干扰序列与其他基因没有显著的同源性，并将合成的具有发夹结构的寡核苷酸链克隆到BS/U6载体；然后将shc-jun同大鼠源的c-jun表达质粒用脂质体转染法共转染293细胞，Western Blot检测对外源性c-jun的干扰有效性，将shc-jun同β-gal用钙磷沉淀的方法共转染小脑颗粒神经元，免疫细胞化学方法检测对内源性c-jun的干扰有效性；将干扰质粒同GFP质粒用钙磷沉淀的方法共转染小脑颗粒神经元，Hoechst33258进行核染色，统计干扰质粒对转染细胞凋亡的影响。结果显示：测序表明成功构建了shc-iun质粒；shc-jun能够有效干扰外源性和内源性的c-jun；干扰掉内源性c-jun可以保护性干预撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡。以上结果表明：c-jun siRNA可以保护小脑颗粒神经元，c-Jun在神经元凋亡时起重要作用。
结论：
1．成功构建c-jun干扰质粒；
2．c-jun干扰质粒能够有效沉默小脑颗粒神经元内源性c-jun；
3．沉默内源性c-jun保护小脑颗粒神经元。