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离子通道是继GPCR受体之后第二大疾病治疗靶点，据统计当前离子通道类药物约占药物市场份额的13.4％。寻找离子通道抑制剂是当今治疗的关注点，然而筛选技术欠缺使得离子通道类药物开发受限。本研究利用组合库技术构建相应的动物毒素多肽库和人源抗体库，通过亲和力和表象筛选，寻找靶向钾离子通道Kv1.3及connexin26半通道的有效抑制剂。论文共分为两部分:第一部分为自分泌筛选系统的建立及靶向Kv1.3的动物毒素库筛选;第二部分为基于噬菌体展示的靶向connexin26的人源抗体的筛选及抗体abEC1.1高亲和力突变株的筛选。 第一部分:动物毒液是靶向离子通道的活性多肽的天然来源。然而，目前这种天然资源并未进行充分开发，世界范围内只有少量的毒液种类得到鉴定。这是因为毒素多肽的分离，纯化，优化等都比较困难。本研究中，我们建立了一个靶向离子通道的毒素多肽库筛选系统。该系统中，毒液多肽依靠血小板源生长因子受体的跨膜结构域(PDGFR-TM)锚定于细胞膜上，同时PDGFR-TM域细胞质内偶联TEV蛋白酶（烟草蚀纹病毒蛋白酶）。电压门控钾离子通道Kv1.3，其胞质面偶联TEV底物序列和人工转录因子GAL4-VP16。当Kv1.3与其配体结合时，TEV蛋白酶与其底物接近并发生剪切，接着释放GAL4-VP16，继而启动荧光蛋白tdTomato的表达，荧光阳性细胞通过流式分选技术进行筛选。我们利用该筛选系统寻找靶向抑制Kv1.3通道的天然毒素。天然毒素库是通过在线数据挖掘，确定具有天然毒素Cysteine-knot结构的589个多肽的基因序列，并将其装载入慢病毒表达载体中建立起来的。经过三轮筛选，在27条富集的多肽序列中，25条是已知的Kv1.3抑制多肽，另外两条是第一次发现具有抑制Kv1.3通道的功能。同时，我们还利用该系统对海葵毒素ShK进行优化改造获得了具有长半衰期的突变多肽S1-2。该突变多肽可以高选择性的抑制Kv1.3并且可以抑制大鼠中DNFB诱导的迟发型超敏反应。 第二部分:Connexin26离子通道蛋白是一种广泛存在于人体各组织和器官的跨膜连接通道(Gap Junction)，尤其在耳蜗和表皮上，对于听力、表皮的生长和分化等起着非常重要的作用。编码连接蛋白Connexin26的基因GJB2上的点突变可导致伴随皮肤疾病的耳聋（KID综合征），以及其他形式的非综合征耳聋。已证实基因GJB2的D50N或G45E突变与KID综合征相关，导致细胞膜上形成的Connexin26半通道一直处于开放状态无法正常关闭，从而导致细胞内代谢分子和跨膜离子梯度的丢失，引起细胞死亡。我们运用噬菌体展示库技术从人源组合抗体库中成功筛选到单克隆单链抗体(scFv)abEC1.1。该抗体可特异性结合并阻断活细胞中表达D50N和G45E突变的connexin26通道，对KID疾病及非综合症耳聋的治疗具有重要意义。为了进一步优化abEC1.1对抗原的亲和力(Kd为2nM)，本研究运用酵母展示技术对abEC1.1进行体外亲和力成熟。将abEC1.1重链CDR3区突变后展示于酵母表面，获得库容量为108的突变库，经4轮筛选，获得六条突变序列，六种突变体的亲和力和功能仍需进一步鉴定，以便为abEC1.1的优化改造提供指导基础。