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原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis,PBC)是一类慢性自身免疫性疾病(autoimmune diseases,AID),95%的患者血清中可检测到自身抗体:抗线粒体抗体(anti-mitochondrial antibody,AMA),丙酮酸脱氢酶复合物E2亚基(E2 subunit of the pyruvate dehydrogenase complex,PDC-E2)是其主要自身抗原成分。近年来,PBC的发病率逐年升高,但尚无特效治疗的药物,患者到后期可进展为肝纤维化甚至肝硬化,因此研究自身抗原如何引起PBC发病,寻找对应的治疗靶点刻不容缓。已有大量研究表明,自身抗原反应性T细胞参与多种常见的AID的发病,如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)等。同样,自身抗原反应性T细胞与PBC的发生发展也密不可分,PBC患者肝脏中浸润的大量自身反应性CD8~+T细胞和CD4+T细胞与PBC中小胆管损伤有关。CD8~+T细胞损伤胆管细胞的途径主要有两条,一条是直接通过Fas-fasL途径直接杀伤胆管细胞;另一条主要是通过分泌细胞因子如:穿孔素、颗粒酶等对胆管细胞产生毒性作用,从而损伤细胞引起胆管病变。CD8~+T细胞的增殖、存活与凋亡可能影响其对胆管上皮细胞是否引起损伤及其损伤程度,从而影响PBC的发生与发展。随着microRNA(miRNA)研究技术的成熟,越来越多的研究证实miRNA参与各种AID的发生发展。已有好几项研究证实miRNA参与PBC的发病,miR-506可损伤胆管分泌功能,被认为是潜在的治疗靶点;miRNA-21通过调控促炎因子的分泌促进小鼠模型中器官特异自身免疫性胆管炎的形成。一方面,miRNA可影响CD8~+T细胞的一系生物学活动如:活化、分化、增殖和凋亡;另一方面mi RNA可调节CD8~+T细胞的效应功能来影响AID的进展。课题组在前期的研究发现PBC外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)和T细胞中miRNA表达谱发生变化并在PBC发病机制中产生一定作用,但自身反应性CD8~+T细胞中miRNA的表达情况以及差异表达的miRNA对细胞凋亡的调控机制不太了解。本课题将首先检测PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miRNA表达变化,再进一步研究miRNA调控凋亡的可能机制。第一部分PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p表达下调且CD8~+T细胞凋亡减少先使用PDC-E2自身抗原肽刺激正常人外周血单个核细胞(PBMC)后,磁珠分选出CD8~+T细胞即为PDC-E2反应性CD8~+T细胞。对细胞RNA进行抽提及质量鉴定后进行miRNA芯片筛选,并结合前期PBC外周血T细胞芯片结果,选择在CD8~+T细胞中表达发生明显下调的miR-223-3p进行研究;同时利用RT-PCR对芯片结果中下调的miR-223-3p进行验证,二者结果相同。我们发现PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p表达减少,为对照组的0.47倍。同时使用流式细胞术检测PDC-E2自身抗原肽刺激后CD8~+T细胞的凋亡情况,发现PDC-E2反应性CD8~+T细胞凋亡减少。第二部分CD8~+T细胞中miR-223-3p对细胞凋亡的影响为了解PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p的下调与CD8~+T细胞凋亡是否有关联,我们往PBMC中转染miR-223-3p的mimic以及inhibitor,之后再使用PDC-E2自身抗原多肽刺激,分选CD8~+T细胞,检测细胞凋亡情况,发现miR-223-3p在PDC-E2反应性CD8~+T细胞中的表达与细胞凋亡之间的关系为正相关,转染miR-223-3p的mimic促进CD8~+T细胞凋亡,而转染miR-223-3p的inhibitor则抑制细胞凋亡,结果与第一部分PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p表达下调且CD8~+T细胞凋亡减少是一致的,由此可见PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p可调控细胞凋亡。第三部分miR-223-3p通过靶基因IGF-1R调控细胞凋亡我们首先通过多个网站预测miR-223-3p的靶基因并选择与凋亡相关的靶基因IGF-1R,然后从基因、蛋白水平验证靶点。为了解miR-223-3p调控细胞凋亡是否是通过作用于靶基因IGF-1R来实现的,我们设计并合成IGF-1R的siRNA来沉默IGF-1R,再检测CD8~+T细胞凋亡是否改变。结果发现:转染siRNA以后,PDC-E2反应性CD8~+T细胞凋亡增加,与第二部分mimic组结果相同。说明PDC-E2反应性CD8~+T细胞中miR-223-3p以IGF-1R为靶点对细胞凋亡起正向调控作用。综上所述,我们发现miR-223-3p在PDC-E2反应性CD8~+T细胞中表达下调,并且miR-223-3p可通过靶基因IGF-1R对调控CD8~+T细胞凋亡。这种情况可能与IGF-1R参与凋亡通路有关,miR-223-3p也许是通过这种调控方式参与PBC的发生发展。