论文部分内容阅读
稻瘟菌(Magnaporthe grisea,无性世代为Pyricularia oryzae)引起的稻瘟病是水稻最严重的真菌病害之一,每年给水稻生产带来重大的经济损失。稻瘟菌与水稻的互作符合基因对基因关系,现已被作为模式系统用于研究病原微生物-植物寄主的互作机理。稻瘟菌致病分子机制的研究不仅为病害的防治奠定理论基础,也为其它植物病原真菌的研究提供借鉴。 本研究利用农杆菌介导的遗传转化体系构建稻瘟菌的T-DNA插入突变体库,使突变体数增加到6855个,每转化1.0x10~6个分生孢子可得到约300个T-DNA插入突变体。抽取最早构建的1600个突变体分别接种在感瘟病水稻品种日本晴和抗瘟病品种C101(对照)上,以测定其致病力的变化,同时对其形态学进行观察分析。结果得到173个菌落形态、分生孢子产生能力或附着胞发育等不正常的突变体。这173个突变体中,有23个对日本晴的致病力从原来的正常下降到完全不能致病,26个致病力明显减弱。 从173个突变体中随机选取28个,进一步开展形态发育观察,结果发现15个颜色异常,7个菌落生长缓慢,2个分生孢子形态异常,2个附着胞形态异常,3个不能形成附着胞。用标准菌株1528和P131检测这28个突变体有性世代的形成能力,结果发现,Y34-0211、Y34-1469和Y34-0635三个突变体完全丧失产生有性世代的能力,其余参试突变体的有性世代形成能力保持不变。 对这28个突变体的基因组进行了PCR扩增,结果从所有参试基因组中都能扩增到潮霉素磷酸转移酶基因(hph)序列,表明突变体的基因组中确实已经携带hph基因序列。用T-DNA左边界系列设计3个嵌套引物和AD9作为随机引物,以28个突变体基因组DNA作为模板,进行TAIL-PCR扩增。结果从6个突变体的基因组上扩增到T-DNA插入位点左侧的DNA片段。对这些左侧序列测序并与稻瘟菌基因组进行比对,获得如下T-DNA插入位点附近的序列资料: T-DNA在Y34-0635和Y34-0528-2基因组上的插入位点相同。该位点位于Ⅲ号染色体重叠群2.973上的53458bp处,其下游约1.0kb处有一个推测的蛋白编码基因MG05254.4。T-DNA的插入可能使上游调控序列不能发挥正常的作用而导致MG05254.4基因无法正常表达,其表型效应是对日本晴的致病力显著减弱(Y34-0635突变体)或完全丧失(Y34-0528-2突变体)。 T-DNA在Y34-0121和Y34-0588基因组上的插入位点都是在稻瘟菌Ⅱ号染色体重叠群2.387上的54377bp处,该插入位点刚好是在末知蛋白MG02065.4和MG02064.4编码基因之间。其表型效应只是分生孢子产孢量略有变化(Y34-0121和Y34-0588突变体)和附着胞形成能力显著降低(Y34-0121突变体)。因此推测T-DNA