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西尼罗河病毒(West Nile Virus，WNV)可引起发烧，皮疹，严重者可引发脑炎和脑膜炎，导致死亡。西尼罗河病毒热是一种严重的疾病，对公众健康造成极大影响。囊膜蛋白(E)是西尼罗河病毒主要的结构蛋白，具有较强的免疫原性，能诱导产生西尼罗河病毒中和抗体，从而对西尼罗河病毒的感染产生保护性免疫作用。
本研究通过对西尼罗河病毒E基因的的克隆和表达，获得重组蛋白E，以该蛋白作为免疫原，制备多抗血清，又以E蛋白作为抗原，检测西尼罗河病毒E蛋白多克隆抗体，从而建立一种简单、高效、快速的间接ELISA检测西尼罗河病毒抗体的方法。
本研究第一部分对西尼罗河病毒的研究进展做一综述。第二部分对西尼罗河病毒E基因进行克隆和表达。以含有西尼罗河病毒E基因的pcDNA为模板，通过PCR扩增获得全长E基因，与pMD18-T连接得到重组克隆载体pMD18-T-E，利用BamHI和Sal1分别对重组克隆载体pMD18-T和表达载体pET-32进行双酶切，并将酶切所获得的E基因定向克隆至原核表达载体pET-32，构建重组质粒pET-E，鉴定为阳性者，转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG,于28℃诱导培养4h，通过SDS-PAGE鉴定，获得相对分子量大小为73kDa的重组蛋白。Western blotting鉴定结果显示，该重组蛋白能与WNV多抗血清发生特异性结合。通过大量诱导表达，切胶回收表达产物，获得纯度较高的目的蛋白，为制备多抗血清和建立间接ELISA方法提供抗原。
第三部分以纯化的E蛋白作为抗原建立间接ELISA检测西尼罗河病毒抗体的方法。先以重组蛋白E为免疫原，用生理盐水稀释一定倍数，与弗氏完全佐剂和不完全佐剂等体积混合充分乳化，按间隔10天的免疫程序进行免疫兔子。四免后心脏采血，利用间接ELISA方法检测血清抗体水平，结果显示抗体效价可达1:300000。然后以E蛋白为抗原包被酶标板，建立检测西尼罗河病毒E蛋白抗体的间接ELISA方法。确定间接ELISA方法的最佳条件为：抗原包被浓度为2μg/mL，血清稀释倍数为2000倍，酶标二抗稀释倍数为8000倍，抗原包被条件为37℃th，然后于4℃过夜，封闭条件为10％小牛血清封闭90min，抗原和血清的反应时间为90min，血清和酶标二抗的反应时间为60min，底物作用条件为37℃15min，阴阳相临界值为0.077。通过特异性试验和重复性试验，表明该方法特异性强、重复性好。并且采用已经建立好的间接ELISA方法，对随机采取的25份鸡血清进行西尼罗河病毒抗体的检测，结果表明均为阴性。
本研究成功对西尼罗河病毒E基因进行克隆和表达，并以该基因表达的E蛋白为抗原，成功建立一种简单、高效、快速的间接ELISA方法，用于西尼罗河病毒E蛋白抗体的检测。这为进一步建立诊断试剂盒奠定了物质基础，为西尼罗河病毒抗体检测提供一种良好的技术手段。