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目的:系统评价各种日本血吸虫核酸检测技术的诊断价值,并采用综合评价较高的重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification,RPA)技术,建立一种特异、敏感、快捷的日本血吸虫核酸检测方法,并初步评价其应用于感染早期检测的潜在价值。方法:计算机检索1990年1月-2019年6月中国知网、万方、ScienceDirect和PubMed数据库中公开发表的与日本血吸虫核酸检测相关的文献,并结合手工检索和参考文献追溯法以最大程度地保证文章的查全。严格按照纳入与排除标准对文献进行筛选,纳入符合条件的文献并提取其中相关数据,采用Meta分析法对各种核酸检测技术的诊断价值进行综合评价。选择日本血吸虫Sj28S基因片段为靶序列,应用手工筛选法并辅以Primer Premier 5软件设计引物,进行温度、时间的优化以确定最佳反应条件,构建基于基础反应体系的RPA检测方法。提取日本血吸虫及其他寄生虫基因组DNA评价所建立方法的特异性。评价方法的敏感性,并与PCR和LAMP法的敏感性进行比较。此外,评价方法对血吸虫不同虫期基因组DNA的检出性能。制备血吸虫阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,评价RPA方法的最低检出混合度和稳定性。建立5条、10条、20条、40条尾蚴梯度感染小鼠的动物模型(不同组别分别简称为“5尾组”、“10尾组”、“20尾组”、“40尾组”),并于感染后第3d、lw、2 w、3 w、4 w、5 w、6 w收集小鼠粪便及血清样本,编号后进行冷冻保存。毛蚴攻击感染钉螺,于感染后第1 d、3 d、5 d、1 w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10 w、11 w分别收集10只钉螺样本,解剖镜检后进行冷冻保存。提取小鼠和钉螺样本的DNA,进行PRA与PCR两种方法的平行检测,综合评价RPA方法检出血吸虫早期感染的效能。结果:Meta分析共纳入19篇文献,其中中文文献5篇、英文文献14篇;共24组研究,其中17组研究涉及变温扩增技术与金标准的比较、7组研究涉及等温扩增技术与金标准的比较。文献质量评价结果表明,所纳入文献总体偏倚较小;Deek漏斗图提示变温扩增技术相关文献可能存在发表偏倚。变温扩增技术各研究之间存在非阂值效应引起的异质性,采用随机效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为0.81(95%CI:0.79-0.83)、特异度为0.73(95%CI:0.7]-0.74)、SROC曲线下面积为0.944 3。等温扩增技术各研究之间不存在异质性,采用固定效应模型对合并效应量进行分析,结果显示:检测日本血吸虫病的综合灵敏度为 0.96(95%CI:0.94-0.98)、特异度为 0.95(95%CI:0.94-0.97)、SROC 曲线下面积为0.989 9。构建的RPA方法可成功地扩增出日本血吸虫216 bp大小的目的基因片段。RPA的最佳反应条件最终选择为390C、20 min。该方法与曼氏血吸虫、埃及血吸虫、单尾尾蚴感染钉螺、华支睾吸虫、大片吸虫、卫氏并殖吸虫和牛带绦虫及阴性钉螺基因组DNA均无交叉反应。RPA法对于日本血吸虫成虫基因组的最低检出限为100 fg/μl,针对重组质粒的最低检出限为100拷贝/μl,且敏感性高于普通PCR和LAMP法。RPA法对日本血吸虫不同发育阶段的基因组DNA样本进行检测,各虫期均能被准确检出。应用建立的RPA方法检测阳性钉螺及阴性钉螺不同混合比例的DNA样本,结果显示,最低检出比例为1:1000。重复性试验结果显示,该方法重复性好且准确性高。动物模型结果显示,RPA法对20尾组小鼠可在第4 w检出粪便DNA阳性,10尾组和40尾组均可在第5 w检出粪便DNA 阳性,5尾组的低感染组仅在第6 w检出阳性。PCR方法对10尾组、20尾组、40尾组小鼠均可在第5 w检出粪便DNA阳性,5尾组仅可在第6 w检出粪便DNA阳性。针对小鼠血清样本的检测结果如下,RPA方法检测5尾组小鼠血清时于第5 w、6 w检出阳性结果,10尾小鼠血清于第2w、4w、6w检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第3w、4w、5w、6w检出阳性结果,40尾组小鼠血清于第3d、lw、2 w、4 w、5 w、6 w均检出阳性结果。PCR法检测5尾组、10尾组小鼠血清时未检出阳性结果,20尾组小鼠血清于第4 w检出阳性结果,40尾组于第6 w检出阳性结果。钉螺的试验结果显示,压碎镜检法在感染第6w及之前均未观察到阳性结果,于感染第7w开始观察到血吸虫的子胞蚴结构。压碎镜检法对钉螺每个时间点检出的阳性率分别为:0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、0%、10%、30%、20%、40%、30%;RPA 法的阳性率分别为:80%、60%、50%、60%、40%、60%、60%、50%、20%、20%、80%、50%、50%、50%;PCR 法的阳性率分别为:60%、70%、60%、50%、20%、0%、30%、0%、20%、0%、10%、30%、50%、50%。其中,压碎镜检阳性的钉螺共有13只,经RPA检测结果均为阳性,PCR方法仅将其中9只(69%)检出阳性,未能将镜检阳性钉螺全部检出。结论:变温扩增技术和等温扩增技术均对日本血吸虫病有较高诊断价值,其中等温扩增技术诊断准确性相对更高。本研究应用等温扩增RPA技术构建了一种日本血吸虫核酸检测方法,该方法敏感性高、特异性好、简便快速,有望用于血吸虫感染的快速检测及风险监测,具有较好的应用前景。