橄榄绿链霉菌Streptomyces olivaceoviridis A1木聚糖酶基因xynB在毕赤酵母中的高效表达

来源 :中国农业科学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:Cary1986
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木聚糖酶是可将木聚糖降解为低聚糖和木糖的一类酶的总称。它广泛地存在于各种微生物中,在饲料、造纸、食品医药以及能源工业中有着广阔的应用前景。我们将来源于橄榄绿链霉菌A1(Streptomyces olivaceoviridis A1)的木聚糖酶基因xynB的成熟蛋白编码序列克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9α中,转化Pichia pastoris GS115得到重组子,实现了木聚糖酶基因xynB的高效表达,表达产物能有效分泌且具有正常的生物学活性。在3升发酵罐中木聚糖酶的表达量达1200IU/mL。SDS-PAGE分析表明,毕赤酵母表达产物XYNBa的分子量为31kD,大于橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB的23kD。进一步对XYNBa进行了脱糖基化处理得到XYNBb,其分子量恢复到23kD,证明XYNBa是糖基化蛋白。通过对毕赤酵母重组表达的木聚糖酶XYNBa、脱糖基化的木聚糖酶XYNBb以及橄榄绿链霉菌A1所产原酶XYNB之间酶学性质的比较发现:三种酶的最适pH差异不大,XYNB和XYNBa均为5.2,XYNBb为5.0;XYNB和XYNBa的最适温度均为60℃,XYNBb降为50℃:在耐热性上,XYNBa由于糖基化作用热稳定性明显高于未糖基化的XYNB和XYNBb;XYNBa和XYNBb的比活性分别为883.88IU/mg和832.51IU/mg,明显低于原酶的比活2814.45IU/mg;XYNB和XYNBa的Km值相当,分别为21.56(g/Kg)和20.87(g/Kg),而XYNBb的Km值较大为27.10(g/Kg);XYNBa和XYNBb的Vmax相差不大,分别为4568μmol/mg·min和5329μmol/mg·min,明显低于XYNB的27623μmol/mg·min此外三种酶均无纤维素酶活性,对胃蛋白酶和胰蛋白酶有很好的抗性,且对作用环境中的各种离子、表面活性剂、螯合剂不敏感。通过对不同木聚糖的酶解产物的糖份分析发现:以桦木木聚糖为底物时,酶解产物主要为木三糖和木四糖,含量分别为68.43%和16.50%,另外还含有11.79%的木二糖;以玉米芯木聚糖为底物时,酶解产物主要为木二糖和木三糖,含量分别为81.78%和11.55%。证实该酶为内切β—1—4木聚糖酶,非常适用于低聚木糖的工业化生产。
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