【摘 要】
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在癌症患者日渐增长以及细菌耐药性越来越重,抗癌抗菌药物的选择极其有限的当下,多肽类药物因具有很高的抗肿瘤抗菌能力、高生物相容性,且不易产生耐药性,因而受到科研人员的青睐。然而,受限于蛋白酶解稳定性差、溶血和细胞毒性强、选择性差等缺点,导致临床上应用率较低。因此,研究并开发出选择性强、高效低毒的多肽药物迫在眉睫。为了提高多肽药物的稳定性和选择性,以及降低溶血和细胞毒性,研究者们提出了很多策略,比如用
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在癌症患者日渐增长以及细菌耐药性越来越重,抗癌抗菌药物的选择极其有限的当下,多肽类药物因具有很高的抗肿瘤抗菌能力、高生物相容性,且不易产生耐药性,因而受到科研人员的青睐。然而,受限于蛋白酶解稳定性差、溶血和细胞毒性强、选择性差等缺点,导致临床上应用率较低。因此,研究并开发出选择性强、高效低毒的多肽药物迫在眉睫。为了提高多肽药物的稳定性和选择性,以及降低溶血和细胞毒性,研究者们提出了很多策略,比如用D-氨基酸替换天然氨基酸、聚乙二醇化、环化等。本课题基于环化提出了可逆环化策略,旨在设计一种连接子将天然线性肽环化,使其在肿瘤部位的响应因子作用下断裂释放出天然线性肽;或者预先破坏天然环肽,利用特定的条件使其在感染部位重新成环,达到降低天然肽的毒性,提高稳定性,以及靶向性的作用。主要研究内容分为以下几部分:1、调查多肽药物目前的临床应用,以及其来源、分类、结构特征、作用机制、现有的优化策略等,最后提出本课题的科学设想。2、设计并合成了GSH响应型的可逆环化的连接子a和不可逆环化的连接子c,选择靶向赖氨酸特异性去甲基化酶1（LSD-1）的肽（SNAIL1）作为研究对象,该肽因与细胞膜发生蛋白-蛋白相互作用,而跨膜能力较差且酶解稳定性也较差。为了提高其膜通透性和稳定性,本课题合成并确证了该天然链肽1,分别使用连接子a和连接子c将其环化得到环肽2和环肽4;为了扩大该策略的应用范围,将环肽2的连接子部分与炔基生物素通过点击反应对接,得到环肽3。通过系列实验证明了环化提高了肽的穿膜能力和稳定性,且在肿瘤细胞内的GSH作用下,连接子a能够断裂释放出原始线性肽以及对接的生物素,起到递药作用;而与正常细胞相比,肿瘤细胞高表达LSD-1,即使环化提高了多肽的膜通透性,也不会导致细胞毒性。3、设计并合成了H2O2响应型的可逆环化连接子b,选择因具有稳定α-螺旋二级结构而导致高溶血和细胞毒性的天然肽MAP作为研究对象,旨在通过环化预先破坏其二级结构,达到降低溶血和细胞毒性以及提高稳定性,使其到达肿瘤部位再释放出原始链肽,杀死肿瘤细胞。天然肽MAP由丙氨酸、亮氨酸以及赖氨酸构成,为了便于连接子b与其环化,本课题设计了两条改造肽MAP-1和MAP-2,为了测试改造肽和天然肽的活性是否有差异,进行了肿瘤细胞筛选,发现改造肽和天然肽的生物活性基本一致甚至更好。因此使用连接子b将MAP-1和MAP-2环化得到RC-MAP-1和RC-MAP-2。通过圆二色谱确证了环化能够破坏链肽的二级结构,而在H2O2的作用下,其二级结构又能恢复成α-螺旋。通过溶血和细胞毒性实验,证明了环化可以降低链肽的溶血作用和细胞毒。通过系列抗肿瘤实验证明,在肿瘤部位过表达的H2O2作用下,连接子b能够顺利的断裂,释放出原始链肽,将肿瘤细胞破坏。且环化之后的可逆环化肽稳定性比链肽要更强。4、设计并合成了基于365nm紫外光的光敏Fmoc-Cys（o NV）-OH,选择因具有稳定β-折叠结构而导致高溶血作用的具有两个二硫键的天然环状抗菌肽TP为研究对象,旨在将TP上的天然氨基酸Fmoc-Cys-OH替换成带有光敏基团的Fmoc-Cys（o NV）-OH,导致不能形成二硫键,而达到预先破坏其二级结构的作用,达到降低天然环肽的溶血毒性,在感染部位通过365nm紫外灯光照,光敏基团掉落,暴露出巯基形成二硫键,恢复成天然环状,达到提高多肽药物的选择性和起到靶向释药的作用。因TP具有两个二硫键,所以设计改造并合成了两条肽TP-1和TP-2。通过对其进行圆二色谱试验,证明了将TP的二硫键破坏能改变其β-折叠结构,而在365nm紫外灯光照下又能恢复。通过溶血实验可知,TP-1的溶血作用大大降低了,而TP-2则与天然环肽基本一致,是由于Cys3-Cys16是导致β-折叠的必要条件,TP-2没有破坏该二硫键,所以还具备溶血毒性。因此,抗菌实验基本使用TP-1和对照组TP来进行,通过抗菌实验,证明了在光照条件下,TP-1的光敏基团能成功掉落,暴露出巯基形成二硫键,恢复成天然环肽TP,达到靶向杀死细菌的作用。
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