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精子获能是受精前的一个过程,对于产生高质量的活胚胎至关重要。虽然在理解精子获能过程中的信号通路方面已经取得了很大的进展,但构成这些过程的分子基础仍有待阐明。受精前的许多过程,例如精子获能,是蛋白质依赖性的,通过这种方式,蛋白质的翻译后修饰在获能机制中起着关键作用。同时已经表明,在获能期间,精子可以取代降解的蛋白质或合成新的蛋白质,这对于获能和受精过程都是必不可少的。蛋白质组学已应用于哺乳动物精子获能的研究,其分子机制已从人类和公牛等物种中得到阐明。质谱分析是蛋白质组学中应用的一项综合技术,它可以用来阐明细胞中的蛋白质水平及其组成。因此,本研究通过采取延边黄牛种公牛精液进行体外获能和非获能比较,利用蛋白组学分析两组蛋白的表达差异。本试验从20头中选择3头3-5岁、健康无疾病的延边黄牛,取其精液,编号分别为A、B、C,设置获能和非获能两个处理组。试验主要分为两个部分进行:第一部分主要对延边黄牛获能精子生理生化特征变化进行研究,具体为通过微生物动(静)态图像检测系统(CASA),检测牛精子的生物学特性;采用考马斯亮蓝染色法和低渗肿胀法检测精子质膜和顶体膜的完整性;提取两个处理组样品的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于磷酸化分析:通过JC-1染色,检测精子获能前后线粒体膜电位的变化;通过流式细胞仪(BDaccuri C6),检测精子细胞凋亡和质膜膜脂质紊乱情况;以及观察获能精子与牛卵母细胞的体外受精及发育。第二部分主要是对获能和非获能精子的蛋白质组进行鉴定和蛋白通路的分析。具体为提取获能和非获能处理组的精子蛋白,进行SDS PAGE和Western Blot用于质谱分析,本试验选用的是液相色谱-质谱分析(LC-MS);通过GO富集、KEGG Pathway富集、蛋白间相互作用(PPI)进行生物信息的分析。试验结果如下:1.经微生物动(静)态图像检测系统(CASA)检测,延边黄牛获能精子的活率、质膜和顶体膜完整性以及线粒体膜电位水平均低于非获能处理组;2.经微生物动(静)态图像检测系统(CASA)和Western Blot检测,延边黄牛获能精子的曲线速度、蛋白酪氨酸磷酸化水平高于非获能精子;3.经流式细胞仪(BDaccuri C6)检测,延边黄牛获能精子的凋亡及膜脂质紊乱程度大于非获能精子;4.延边黄牛精子获能后与卵母细胞进行体外培养,卵裂率可达到46%以上;5.与未获能精子相比,获能精子中89个蛋白表达上调,509个蛋白表达下调;6.经Western Blot分析,获能精子组(H)PSMD1和HSPA5的表达水平明显低于未获能精子组(F)。本试验利用蛋白组学分析了延边黄牛体外获能和非获能精子的蛋白表达差异,发现在精子获能过程中有89种蛋白表达量上调,509种蛋白表达量下调,用Western Blot检测PSMD1蛋白和HSPA5蛋白的表达水平,观察到获能后,PSMD1和HSPA5的表达量均下调。我们发现的精子获能过程中这些关键蛋白的变化,有助于筛选影响精子获能的关键蛋白,增强了我们对延边黄牛精子获能的一些分子过程的理解,对深入了解精子发生调控机制有参考价值,并为进一步研究这一过程提供了框架。