【摘 要】
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通过对制备材料、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一套制备指状青霉(Penicillium digitatum)原生质体的有效方法,并在双层
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通过对制备材料、酶液浓度、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂的种类和浓度等因素的实验研究,得到了一套制备指状青霉(Penicillium digitatum)原生质体的有效方法,并在双层培养基上初步实现了原生质体的再生,再生率可达24.9％.此外,还对原生质体的释放和再生方式进行了跟踪观察.原生质体释放有顶端、侧端和原位释放3种方式.原生质体的再生有2种方式,一种是原生质体一端突出形成酵母出芽状细胞;另一种是在原生质体一端直接长出菌丝.该研究构建了指状青霉对抑霉唑敏感和抗性的两个CYP51基因的pCB1004表达载体,并对基因的插入方向和拷贝数进行了分析,证明了两个载体连接的基因均为正向连接和单拷贝插入.采用PEG法和电击法两种方法进行指状青霉原生质体的转化,然后将得到的转化产物转移到查氏再生培养基中培养,遗憾的是没有得到理想的转化子.采用高效液相色谱技术(HPLC)分析了对抑霉唑敏感和抗性的两种指状青霉菌株(分别为pd23和pd07)中游离麦角甾醇的含量并比较了两者之间的差异.结果表明,在抗性菌株pd07不加抑霉唑的情况下,pd07和pd23中游离麦角甾醇的含量采用Duncans新复极差测验在5％水平没有明显差异;但当pd07中加入0.1μg/ml抑霉唑时,三次重复测定结果显示抗性菌株pd07中麦角甾醇的含量明显地要比敏感菌株pd23中的含量高,而且两者在5％水平上差异显著.推测抗性菌株中麦角甾醇含量的积累是需要抑霉唑等药物诱导的.与敏感菌株相比,抗性菌株CYP51基因启动子上游多了4个126bp的串联重复序列,推测该重复序列可能是导致CYP51基因过量表达的内在原因.
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