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目的：利用同尾酶构建基因同向串联体的方法，构建Alloferonl基因2串联体重组质粒，并将其在大肠杆菌中融合表达。为大规模制备Alloferonl奠定基础。
方法：根据瑞士微生物肽数据库(APD)收录的Alloferonl氨基酸序列，选择大肠杆菌偏爱密码子设计并合成该基因序列。利用同尾酶法构建同向串联体的要求，在目的基因的5’端引入EcoRI酶切后的粘性末端，并在其后引入XbaI的酶切位点；在目的基因的3’端引入SalI酶切后的粘性末端，并在其前引入NheI的酶切位点，同时在XbaI位点后和NheI位点前引入蛋氨酸(Met)密码子(ATG)，构成溴化氰(CNBr)裂解位点。将合成的Alloferonl基因克隆到载体pUC18上，转化大肠杆菌DH5α，即可获得Alloferonl单拷贝工程菌。利用XbaI(T▽CTAGA)与NheI(G▽CTAGC)互为同尾酶的特性，二酶切割后的粘性末端均为CTAG，可以进行连接，但连接后的新序列TCTAGC不被二酶再识别，采用ScaI(pUC18上位于多克隆酶切位点外的一个酶切位点)/XbaI和ScaI/NheI分别双酶切单拷贝重组质粒，回收大片段pUC18-Alloferonl和小片段Alloferonl，进行连接，转化DH5a，用EcoRI和SalI双酶切重组质粒即可得到Alloferonl 2拷贝串联体。将其与pGEX-4T-1表达载体连接，转化大肠杆菌BL21，即可获得Alloferonl 2拷贝串联体工程菌。对IPTG诱导时机、IPTG诱导温度和IPTG诱导时间等条件进行摸索，最终确定了最佳表达条件：当菌液A600nm≈0.8时加入终浓度为0.5mmol/L IPTG诱导表达4h后，经SDS-PAGE电泳观察融合蛋白得到了可溶性的高效表达。用GSTrapFF 1ml预装柱手工进行GST融合蛋白的纯化，经SDS-PAGE电泳观察得到了Alloferonl 2拷贝融合蛋白(31KD)。
结果：
1、按照设计的方案进行操作，获得了Alloferonl基因2串联体，经EcoRI和SalI双酶切pGEX-4T-1-(Alloferonl)2重组质粒之后，在约110bp处可见一条清晰的DNA条带，其大小与理论计算值相符。
2、重组的pGEX-4T-1-(Alloferonl)2质粒DNA经双脱氧末端终止法测序，结果证明，本研究构建的Alloferonl基因2串联体的核苷酸序列和阅读框完全正确。 3、含重组pGEX-4T-1-(Alloferonl)2的菌液经终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导表达后，经SDS-PAGE分析，在37℃诱导表达4h后，在细菌裂解上清中出现了一条Mr约为31×103的新生GST融合蛋白带，其分子质量大小与理论计算值相符。
结论：本研究成功构建了Alloferonl基因2串联体重组质粒，获得了可成功表达相应目标融合蛋白的2拷贝串联体工程菌。对其表达条件进行了优化，获得了具有较高纯度的Alloferonl 2拷贝融合蛋白(31KD)，为进一步纯化得到Alloferonl单体及其抗病毒活性测定奠定了基础。