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牡蛎(Concha Ostreae)中的多糖具有良好的免疫调节、抗氧化、抗病毒和降血糖活性。目前，牡蛎多糖的提取分离方法常用有热水浸提法，柱层析法，但是存在步骤繁琐、操作时间长，效率低等问题。低分子醇类与无机盐构成的双水相体系具有成本低廉、溶液条件温和等优点，能够根据被萃取物的性质进行组成成分和比例的调整，达到最优的萃取效率并确保其活性。本课题以来自闽南地区海域的太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)为原料，筛选出富集分离牡蛎中性多糖和酸性多糖效果最佳的低分子醇/盐双水相体系，进而分别对分离得到的两种牡蛎多糖组分进行化学结构分析和生物活性研究。主要研究内容如下： (1)对牡蛎粗多糖进行超声微波提取条件的响应面优化实验。得出响应面优化结果：超声-微波辅助技术提取牡蛎多糖的最佳工艺条件为：提取时间26.26min，料液比1:102，温度82℃。与传统的水浴浸提法相比，超声-微波提取法可以将传统水提的3h缩短到26min，得率由24.55％增加到27.48%。进一步对该优化的实验条件进行验证，获得牡蛎粗多糖优化得率Y=27.48?0.2%，以此作为牡蛎粗多糖提取的最佳提取条件参数。 (2)通过上述实验条件处理，获得的牡蛎粗多糖通过双水相体系进一步分离纯化。首先，确定双水相体系的相平衡数据，然后通过本实验室开发的双水相体系相平衡数据拟合软件(ATPS-LLE)运行出双水相体系双节线和系线长度（TLL）。 (3)其次，考察双水相体系类型（乙醇/(NH4)2SO4体系，PEG1000，PEG2000，PEG4000分别与(NH4)2SO4形成的双水相体系），系线长度（TLL=30，35，40，45，50）和不同浓度的牡蛎粗多糖对多糖分离纯化的影响，采用苯酚-硫酸法测定两相中的牡蛎多糖浓度，BCA法测定两相中蛋白质浓度。实验结果表明：（27.29wt%）乙醇/(17.7wt%)硫酸铵双水相体系能够很好的富集分离小分子量的牡蛎中性多糖与大分子量的牡蛎酸性多糖，并且去除蛋白和杂质，多糖粗提液在9mg/mL混合分相后，下相多糖收率为53.21%，成品多糖中蛋白质含量为0.32%，说明双水相富集的方法分离步骤少，条件温和，可获得高收率和高纯度的小分子中性多糖，并且可以用于大量制备。 (4)本实验通过上述乙醇/(NH4)2SO4体系与传统方法（乙醇沉淀，DEAE-纤维素-52柱层析等）分离纯化牡蛎粗多糖，分别得到天然的牡蛎中性多糖和酸性多糖用于牡蛎多糖生物活性研究。采用MTT比色法研究牡蛎多糖在体外对人肝癌细胞Hepg-2的抑制增殖实验，传统方法分离的中性多糖（OGN1）的抑制率为52.94%，双水相分离得到的牡蛎中性多糖(OGN2)抑制率为55.81%，说明OGN2的抑制效果更好。通过Annexin V-FITC细胞凋亡检测到OGN2具有明显的诱导肝癌细胞Hepg-2凋亡和死亡的作用。在对正常小鼠脾淋巴细胞的增殖活性实验的测定中，OGN2增殖效果同样最佳，增值率达到121.08%，对小鼠脾淋巴细胞形态学观察和白介素-2(IL-2)的释放量的比较能够得知OGN2在250μg/mL时对小鼠脾淋巴细胞IL-2的刺激指数达到124.81%，能够有效的提高小鼠脾淋巴细胞免疫活性。由于牡蛎多糖是一种动物多糖，含有一定量的糖蛋白，说明双水相体系富集多糖时，条件温和对多糖的结构损伤很小，从而相对传统方法得到的多糖也表现出更好的生物活性。 (5)经上述分离工艺的优化组合，可获得大量的小分子牡蛎中性多糖(OGN)组份，大分子酸性多糖(OGA)组份，对二者进行结构解析。HPLC-ELSD仪检测牡蛎多糖单糖组成，主要为葡萄糖，OGA和OGN的葡萄糖醛酸含量分别为1.33%，0.02%。IR光谱可判断，OGN，OGA的主链都为α-D-吡喃型葡聚糖，不同点为OGA中2853cm-1为CH2伸缩振动，1740cm-1，1440cm-1为糖分子中C=O（-COOH）的伸缩振动，说明OGA中含有-COOH，并且含有葡萄糖醛酸。OGN、OGA组分的相对分子质量和纯度进行分析，样品峰型比较对称，纯度较高，计算得到OGN和OGA的分子量分别为3.48KD，980KD。甲基化分析推测OGN的主要结构为：1,4-链接的主链上平均5.98个葡萄糖残基有一个1,3,4-链接的支链，并且有少量1,2,4-链接的支链。OGA的主要结构为：1,4-链接的主链上平均7.51个葡萄糖残基有一个1,3,4-链接的支链。说明多糖OGN和OGA连接方式基本相同，但是OGN支链更多。核磁共振谱分析，多糖连接位置C-1和C-4碳原子位置存在取代或者成键反应，也证实了两种组分都为α-D-吡喃型葡聚糖，本实验中NMR和甲基化分析结果基本相符。OGN和OGA的结构对比其生物活性分析，虽然两种多糖单糖组成和连接方式相同，但是分子量相对较小、未带电荷、支链相对多的中性多糖具有更好的生物活性。 (6)为进一步提高牡蛎多糖组分的生物学活性，采用SO3-吡啶法对多糖OGN2和OGA1进行了硫酸酯化修饰，获得了2种硫酸酯化多糖SOGN和SOGA，测得其硫酸根含量分别为27.22%，16.85%，取代度分别为0.334和0.613。SOGN和SOGA的相对分子量分别为3.38KD，23.4KD。体外小鼠脾淋巴细胞免疫活力实验结果，SOGN增殖率可以到达139.17%，刺激指数也可以达到118.47%，OGN2增殖率为115.66%，刺激指数103.42%，与OGN2相比较，SOGN能够明显的促进小鼠脾淋巴细胞的增殖，免疫活性有所提高。抗肿瘤活性筛选实验方面，SOGN对人肝癌细胞Hepg-2抑制率能够达到57.19%，OGN2的抑制率为52.96%，与OGN2相比较，SOGN的抑制率有所提高。另外牡蛎多糖对狗肾小管上皮细胞MDCK都未产生细胞毒性。SOGN中硫酸基的引入会引起多糖性质、特别是立体构象的变化，从而引起对生物活性的改变。因此，经硫酸酯化后的牡蛎中性多糖显示增强了原来多糖的生物活性。