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乙醇酸氧化酶(GlycolateOxidase,简称GLO)是光呼吸代谢的关键酶,过去对它的研究主要集中在其分子结构和催化特性方面,而对其生理功能的认识尚停留在“它是植物光呼吸代谢的一个关键酶,是光合组织中光促耗氧的主要酶”。发掘GLO新的生理功能并探讨其作用机理具有重要的理论和实际意义:首先,了解GLO在光呼吸调节中的作用可能为提高植物光合效率及生产力开辟新途径;此外,了解GLO在抗逆性中的作用可能为提高植物抗逆性提供新的切入点。本研究采用可调控反义RNA技术和超表达技术来调控GLO活性,以期从分子水平深入探讨GLO新的生理功能及作用机理。获得的主要结果如下:
L反义、正义GLO转基因植株的构建
在对GLO各同源基因cDNA序列分析的基础上选择合适的基因序列,通过构建诱导型反义重组载体并转化拟南芥,获得了反义GLO转基因植株;构建组成型超表达重组载体转化拟南芥,获得了正义GLO转基因植株。
经诱导剂处理,反义转化植株中的GLO活性可得到不同程度的下调,下调幅度在20%~60%之间。在所研究的11个正义转化株系中,GLO活性也得到了不同程度的上调,最大上调量可达近3倍,其它株系的上调比例在40~150%之间。
2.GLO活性下调对植株表型的影响
当GLO活性下调超过30%时,转基因植株就出现明显的表型变异,如出现叶片发育缺陷、生长受抑制等;如在开花结实前进行诱导处理,GLO活性下调50%左右时,转基因植株表现为雄性不育,结实率很低。
3.T-DNA插入失活突变体的GLO活性及表型变化
部分T-DNA插入失活突变体的GLO活性下调幅度在40%左右,这些突变体也出现了明显的表型变异,并且与反义转化植株中观测到的结果很类似,进一步表明GLO对植株生长发育产生重要影响。
4.GLO不同活性水平对叶绿素代谢的影响
当GLO活性下调约45%时,植株叶片中的叶绿素含量明显降低,但此时可溶性蛋白含量及叶绿素荧光参数与对照相比并无明显差异,表明叶绿素含量的降低并非植株整体衰老的结果,而可能是GLO活性对叶绿素代谢产生了较直接的调节作用。相反,在正义转化植株中,GLO活性上调比例越大,其叶绿素含量就越高。进一步表明拟南芥植株中叶绿素含量与GLO活性水平密切相关。
5.GLO活性下调对Pro等氨基酸含量的影响及其可能机理
GLO活性下调对相关的氨基酸含量产生了不同程度的影响,其中脯氨酸(Pro)表现最为敏感,GLO活性下调仅20%时就导致Pro含量降低了一半,当GLO活性下调60%左右时,其Pro含量仅为对照的1/4。其它相关氨基酸如Glu、Ser、Gly的含量在GLO活性下调30%~40%时下降幅度在30%~50%。Ile、Leu、Tyr、Phe、Arg等氨基酸的含量反而增加,增加幅度为2~3倍。
植物中NH3的同化量、Pro及Glu的含量均与谷氨酰胺合成酶(GS)活性相关。本文结果显示:当GLO活性下调时,GS的活性也明显受到了抑制,这可能是导致Pro含量降低的原因。
6.GLO活性下调对植株抗旱性的影响及其可能机理
GLO活性经诱导下调后,植株的抗旱能力明显降低,主要表现为植株的萎焉程度和失水量显著提高。
GLO可能通过影响拟南芥中的Pro含量来影响其抗旱能力,依据如下:(1)GLO活性下调后再处以干旱胁迫前后,植株中的Pro含量均显著低于对照,并且Pro含量变化与植株含水量呈现正相关关系;(2)前人已有大量研究表明,Pro是干旱胁迫中植物体内诱导积累的主要渗透调节物质,其含量与植物的抗旱能力相关。
综上所述,本研究实现了对GLO活性进行不同水平的调控,并在此基础上探讨了GLO的生理功能。结果显示,GLO在拟南芥生长发育、游离Pro等相关氨基酸代谢、叶绿素代谢以及植株抗旱适应等过程中起重要的作用。