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新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）是一种条件性致病真菌,该病菌常通过呼吸道进入人体内引发肺部感染,对获得性免疫缺陷综合征（Acquired immunodeficiency sydrome,AIDS）患者、器官移植受者和癌症患者等免疫力低下的人群具有较高威胁。现有的治疗药物主要包括两性霉素B（Amphotericin B,Am B）、伊曲康唑、氟康唑、5-氟胞嘧啶,其中多烯类广谱抗真菌药物两性霉素B药效最佳,因此在隐球菌感染疾病中被广泛运用。但现有剂型存在半衰期短、靶向性差等不足。目前,为延长药物的体内循环周期,可在药物载体表面修饰聚乙二醇等高分子聚合物,但其属于外源性材料,在体内易被网状内皮系统（reticuloendothelial system,RES）识别进而引发免疫反应,因此应用受限。利用内源性细胞膜包裹药物载体则能够防止被RES识别并清除。同时,基于细胞膜上存在一些能够与病原菌及靶细胞相互作用的受体,可达到赋予制剂靶向性的目的。此种仿生递药策略有可能为抗真菌治疗提供新的思路。巨噬细胞本身属于免疫细胞,其主要生理功能就是吞噬病原体,其表面存在一些功能受体,与新型隐球菌之间存在相互作用。因此我们选用巨噬细胞作为源细胞以发挥其作为内源性生物材料的优势达到长循环的目的,同时利用细胞表面特异性受体能够识别隐球菌的特点起到靶向作用。虽然越来越多具有不同表面特性的仿生递药系统应运而生,但目前仍不清楚纳米内核与外层细胞膜之间的亲和力是否能保证高效的正向包裹。因此本实验室前期设计了一条能特异性结合细胞膜内侧组分磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine,PS）的多肽（简称PS肽）,本课题拟将其修饰在白蛋白纳米粒表面以发挥与细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸结合的功能,以实现细胞膜的高效正向包裹。利用构建好的仿生递药系统负载两性霉素B以达到靶向治疗隐球菌肺部感染的目的。本论文分为三部分,第一部分构建巨噬细胞膜包裹负载两性霉素B白蛋白纳米粒的仿生递药系统,并对其进行理化性质及生物学特性表征。首先合成PS-PEG2000-胆固醇,MALDI-TOF MS图谱结果证明合成所得聚合物的分子量与预期结果一致,通过此聚合物成功将多肽修饰至白蛋白纳米粒表面。采用物理挤压法将细胞膜包裹在白蛋白纳米粒表面,通过马尔文激光粒度仪检测其粒径及Zeta电位,发现粒径增加了约16 nm,符合巨噬细胞膜磷脂双分子层的厚度,同时检测到白蛋白纳米粒的Zeta电位由-14.2 m V变为-21.4 m V,与巨噬细胞膜的电位一致。通过透射电镜观察到圆形白蛋白纳米粒外存在一层环状结构,证明细胞膜完好地包裹在白蛋白纳米粒表面。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳考察巨噬细胞、提取分离的巨噬细胞膜及巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒上蛋白之间的差异。结果显示三者的蛋白条带基本一致,说明在提取分离和物理挤压过程中未对细胞膜上的蛋白造成损伤。蛋白质免疫印迹也检测到SIRP-α蛋白及Dectin-1蛋白的存在,为把巨噬细胞膜上与识别隐球菌相关的生物功能传递给白蛋白纳米粒奠定了基础。荧光共定位也显示细胞膜完好的包裹在白蛋白纳米粒表面。通过高效液相色谱建立了两性霉素B的含量测定方法,检测可知制剂的包封率达到了90%以上,持续监测72 h发现其包封率与粒径均无明显变化,具有较好的稳定性。体外释放实验中巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒的药物累积释放率约为对照组制剂的三分之二,体现了较好的缓释性能。第一部分成功构建了巨噬细胞膜包裹白蛋白纳米粒的仿生递药系统,第二部分对其进行相关体外评价以探究制剂在机体外的各项性能。通过正常巨噬细胞的摄取来模拟网状内皮系统对制剂的摄取情况。荧光显微镜及流式细胞术实验结果均表明细胞膜的包裹可以有效减少巨噬细胞对白蛋白纳米粒的摄取,体现了良好的体外长循环作用。隐球菌对制剂的摄取情况显示巨噬细胞膜包裹白蛋白纳米粒的摄取量明显高于普通白蛋白纳米粒,证明巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒对隐球菌具有靶向性。在相关抗体阻断后,隐球菌对裹膜白蛋白纳米粒的摄取量与裸露白蛋白纳米粒无明显差异,证明巨噬细胞膜上的抗体在特异性识别中起到了关键性作用。隐球菌能够感染宿主巨噬细胞并寄生在巨噬细胞内形成胞内感染源,此种被感染的巨噬细胞能够与正常巨噬细胞发生膜融合,因此我们通过被隐球菌感染的巨噬细胞摄取实验考察制剂是否对感染巨噬细胞也具有靶向性。采用酶标仪检测巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒最小抑菌浓度为1μg/m L,与游离两性霉素B的最小抑菌浓度相同,证实其具有良好的抑菌性能。在前文所述实验基础上继续研究巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒在体内的长循环特性、靶向性、药效及安全性。首先建立了两性霉素B的体内分析方法,药代动力学实验表明巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒半衰期约为普通白蛋白纳米粒的两倍,显著延长了药物在体内的循环时间。考虑到隐球菌感染肺部的自然方式是通过呼吸道进入机体,本课题通过鼻滴隐球菌菌液的方式构建小鼠肺部感染模型。通过活体成像及荧光共定位图片可以证明巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒对真菌感染的肺组织具有靶向性。两性霉素B在小鼠脑、心、肝、脾、肺、肾组织中的分布情况也显示巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒会在肺部聚集,再次印证制剂在体内的肺靶向功能。造模小鼠给药后第一天及第七天解剖,将肺组织匀浆液涂板进行真菌计数发现巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒的治疗效果明显优于对照组制剂。核磁共振分析影像中可以看到经过巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒治疗的小鼠肺部几乎无残留MRI感染信号,生存周期也比对照组小鼠更长,说明巨噬细胞膜包裹的白蛋白纳米粒具有较好的体内药效。最后对制剂在体内的安全性进行了初步考察,谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）四项指标血清生化指标均在正常范围内,病理学切片也无异常,表明制剂对机体无明显毒性。综上所述,本课题成功构建了一种巨噬细胞包裹的白蛋白纳米制剂,融合了细胞膜的生物功能及纳米粒的载体功能。各项体内外实验均证实该递药策略具有良好的长循环功能,同时对隐球菌引发的肺部感染具有靶向性治疗效果,药效优于普通的白蛋白纳米粒,在治疗隐球菌感染方面具有广阔的应用前景。