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对生物催化油脂转酯化制备生物柴油，提高催化剂的甲醇耐受性可增大转酯化反应体系的醇油摩尔比，提高反应效率。本文通过对脂肪酶产生菌的耐甲醇驯化和脂肪酶的固定化两条途径提高生物催化剂的甲醇耐受性。研究了脂肪酶产生菌的筛选及其耐甲醇驯化和脂肪酶固定化方法及效果。从土样中分离出34株脂肪酶产生菌，在维多利亚蓝培养基上初筛出透明圈与菌落直径比值较大的6株菌，复筛出产脂肪酶活性较高的菌株FM-1，其所产脂肪酶主要为胞内酶，产脂肪酶活力为132u/g cell。在培养基中添加0.1%吐温80可促进菌株FM-1的生长。在输出功率560w、工作总时间15min（超声时间5s、间歇时间15s）的条件下，对菌株FM-1培养60h收获的细胞进行超声破碎测得的脂肪酶活力最高。通过反复的驯化培养方式将菌株FM-1驯化成耐甲醇的优良菌株.在甲醇浓度为1.1%(v/v)的培养基中驯化后的脂肪酶相对活力为35%，而原始菌体在此环境中不能生长。采用聚乙烯醇-海藻酸钠复合凝胶球直接吸附固定脂肪酶，在复合凝胶中加入1%活性炭可提高载体吸附能力。在pH5.5、25℃、60rpm条件下，聚乙烯醇-海藻酸钠-活性炭聚合载体对30mg/mL酶液吸附12h，所得固定化脂肪酶活力最高达616u/g载体。吸附固定的脂肪酶较游离酶的最适作用温度升高10℃，最适作用pH范围变宽，且向碱方向偏移0.2个单位。固定化酶在热稳定性、pH稳定性、贮存稳定性、操作稳定性，尤其是在甲醇耐受性方面得到很大提高。