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研究目的：胰腺癌为高度恶性肿瘤，早期诊断困难，手术切除率低，化疗是胰腺癌治疗的重要手段。化疗耐药，尤其是多药耐药现象严重阻碍了化疗药物的应用。神经酰胺作为脂质第二信使可以诱导细胞发生凋亡，研究发现许多化疗药物都可以通过使细胞内神经酰胺含量增加而发挥细胞毒作用。葡萄糖基神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase，GCS)是细胞内位于高尔基体和内质网上的神经酰胺代谢关键酶，它可以清除细胞内的神经酰胺，使神经酰胺糖基化成无细胞毒作用的葡萄糖基神经酰胺(glucosylceramide，GlcCer)，后者是细胞内200多种其他鞘糖脂合成的前体物，并有细胞保护作用，被认为是肿瘤多药耐药的机制之一。GCS参与耐药的现象已在乳腺癌等肿瘤细胞中得以证实，对于其是否参与胰腺癌化疗耐药目前尚无文献报道。本实验室前期利用基因芯片技术，高通量筛选人胰腺癌细胞SW1990及其耐药亚株之间的差异表达基因，发现GCS基因在耐药亚株中呈高表达。因此，本试验旨在进一步探讨GCS基因在胰腺癌获得性耐药中的作用。研究方法：1、通过CCK-8法测定人胰腺癌细胞株SW1990及其耐药亚株SW1990／FU、SW1990／ADM、SW1990／GEM的药物敏感性；2、应用相对定量荧光实时PCR检测SW1990及其耐药亚株细胞内GCSmRNA的表达水平；3、Western blot法检测SW1990及其耐药亚株细胞内GCS蛋白的含量差异；4、构建GCS的真核重组表达质粒pCI-neo-GCS，应用脂质体法将其导入SW1990细胞，检测过表达GCS前后SW1990细胞对5-FU、阿霉素(ADM)、吉西他滨(GEM)的药物敏感性变化，空白载体pCI-neo作为阴性对照；5、应用RNAi技术干扰GCS基因的表达，检测干扰前后SW1990/FU、SW1990/ADM、SW1990/GEM的药物敏感性变化。研究结果：1、CCK-8法检测SW1990及其耐药亚株的药物敏感性结果表明，耐药亚株细胞SW1990/FU、SW1990/ADM和SW1990/GEM分别对5-FU、ADM、GEM的耐药性均明显高于亲本株细胞SW1990，其耐药指数分别为339.7、11.9、56.6；2、相对定量荧光实时PCR结果表明，GCS mRNA在SW1990及其三株耐药亚株中均有表达，GCS mRNA在SW1990/FU、SW1990/ADM、SW1990/GEM中的表达均较SW1990升高，分别是SW1990的1.93、1.16和2.07倍；3、Western blot结果表明，与SW1990相比，GCS蛋白在SW1990/ADM、SW1990/GEM中呈高表达，分别是SW1990的1.22和1.76倍；4、DNA测序和双酶切结果证实成功构建了GCS的真核重组表达质粒pCI-neo-GCS，脂质体法将该表达质粒转染SW1990细胞，应用G-418选择出稳定表达的细胞型SW1990/pCI-neo-GCS；5、过表达GCS后，CCK-8法检测SW1990的药物敏感性显示，与SW1990相比，SW1990/pCI-neo-GCS的耐药性增加，对5-FU、ADM、GEM耐药指数分别是2.63、1.94、1.44；6、RNAi干扰SW1990三株耐药亚株，RT-PCR检测GCS mRNA的表达，结果显示GCS mRNA的表达均明显降低；7、CCK-8法检测RNA干扰后SW1990三株耐药亚株的药物敏感性，结果显示SW1990/ADM和SW1990/GEM的耐药性有所降低，SW1990/FU的耐药性没有变化。研究结论：1、SW1990/FU、SW1990/ADM和SW1990/GEM具有稳定和可遗传的耐药性；2、GCS mRNA和蛋白在SW1990/ADM和SW1990/GEM中均呈高表达，抑制其表达后SW1990/ADM和SW1990/GEM的耐药性降低，说明GCS基因参与了SW1990/ADM对ADM和SW1990/GEM对GEM的耐药发生；3、SW1990/FU中GCS蛋白表达水平无升高，RNA干扰降低GCS基因表达后，对5-FU的药物敏感性没有明显变化，提示GCS基因在SW1990/FU耐药机制中可能并不发挥作用。