【摘 要】
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被子植物通过成花转变过程完成从营养生长向生殖生长的过渡。成花转变受环境因素和植物自身发育状态的精确控制。植物内部复杂的调控网络可以监控环境变化,能够使个体在经历足够的营养生长阶段之后再进入生殖生长阶段,以获得最大的繁殖能力。拟南芥开花时间的调控机制涉及光周期、赤霉素、年龄、自主、春化作用和环境温度等多条途径,分别在不同的生长条件下对成花转变过程起调节作用。本工作研究了EARLI1亚家族基因AT4G
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被子植物通过成花转变过程完成从营养生长向生殖生长的过渡。成花转变受环境因素和植物自身发育状态的精确控制。植物内部复杂的调控网络可以监控环境变化,能够使个体在经历足够的营养生长阶段之后再进入生殖生长阶段,以获得最大的繁殖能力。拟南芥开花时间的调控机制涉及光周期、赤霉素、年龄、自主、春化作用和环境温度等多条途径,分别在不同的生长条件下对成花转变过程起调节作用。本工作研究了EARLI1亚家族基因AT4G12490在拟南芥开花转变过程中的生物学功能。EARLI1亚家族蛋白均由信号肽、PRD功能域和8CM功能域构成,它们的8CM编码序列非常保守。表型观察结果显示,以Col-FRI-Sf2为遗传背景的EARLI1亚家族8CMRNA干扰植株的开花时间明显早于Col-FRI-Sf2野生型植株,说明该亚家族基因在维持拟南芥营养生长和防止拟南芥植株过早进入生殖生长方面具有功能。为了更为深入地研究EARLI1亚家族基因AT4G12490在拟南芥开花调控过程中的作用机制,本工作构建了以AT4G12490基因PRD和8CM编码区为靶标的RNA干扰载体AN-90-PRD和AN-90-8CM,以及包含AT4G12490基因完整开放阅读框序列的过表达载体AN-90,并通过浸花法结合抽真空处理对拟南芥Col-0生态型野生型植株进行了转化,获得了AT4G12490基因的RNA干扰株系和过表达株系。同时,通过PCR方法从杂合性T-DNA插入系筛选得到AT4G12490基因的纯合突变体。对野生型、过表达和RNA干扰植株的表型特征进行比较,证实下调AT4G12490基因能够引起早花,该基因具有维持营养生长、延迟开花的作用。进一步利用这些材料对AT4G12490基因上调、下调或敲除以后不同开花诱导途径主要基因的表达水平进行了分析。在长日照条件下,AT4G12490基因主要在种子苗、成熟莲座叶和茎中表达。它的表达模式与自主途径开花基因FLK与晚花基因FRI最为相似,都主要在茎和叶中表达。AT4G12490基因的表达在个体发育的不同阶段差异较大,在营养生长初期和生殖发育初期转录水平较高。在长日照条件下,AT4G12490、EARLI1和AZI1等EARLI1亚家族基因表现出相似的昼夜节律性表达特征。无论在长日照还是短日照条件下,通过RNA干扰技术降低AT4G12490基因的表达水平后,成花素基因FT和成花整合因子基因SOC1mRNA的积累会增加,并且在长日照条件下这种效果更加强烈；同时,一些促进成花转变的关键基因的昼夜节律性表达模式更为明显。但AT4G12490基因被干扰后,CCA1、LHY、GI等节律钟基因的表达和振荡规律不受影响。另外,随着AT4G12490基因表达水平的下调,春化作用和自主途径中的关键性开花抑制因子基因FLC以及GA信号转导途径的抑制基因RGA的mRNA丰度明显降低,而春化相关基因VIN3和GA生物合成相关基因的表达水平表现上升。高效液相检测结果表明,干扰AT4G12490基因能够增加内源赤霉素含量,这与RNA干扰植株细、高、早花的表型相一致。以上研究结果表明,AT4G12490基因能够影响不同的拟南芥开花途径。为了确定AT4G12490蛋白的亚细胞定位特征,将去除终止密码的AT4G12490基因编码序列连接到pCAMBIA1302载体的绿色荧光蛋白基因之前,构建产生融合表达载体,通过农杆菌介导的叶圆盘转化法获得了35S::AT4G12490-GFP烟草转基因植株。激光共聚焦显微观察发现,AT4G12490蛋白定位在细胞表面,表明该蛋白与感受环境刺激和信号转导有关。AT4G12490基因在烟草中的组成性表达也能够促进营养生长,延迟开花过程。此外,本工作还在大肠杆菌细胞中表达了不含信号肽的AT4G12490重组蛋白。首先从Col-0野生型拟南芥基因组DNA扩增产生8CM-PRD编码序列,并连接到pPROEX-HTb载体中,然后将重组质粒转化到BL21（DE3）大肠杆菌细胞中。SDS-PAGE和Western免疫印迹实验结果表明,用IPTG诱导表达的AT4G12490重组蛋白主要存在于包涵体中。由于在大肠杆菌细胞中表达的融合蛋白带有六组氨酸标签,所以在使用尿素对包涵体进行溶解后,通过Ni-NTA亲和层析柱纯化了AT4G12490重组蛋白。抑菌试验结果显示,用AT4G12490重组蛋白处理后,灰霉菌和酿酒酵母细胞的生长明显受到抑制。同时,在细胞内用半乳糖诱导表达AT4G12490基因也能够使酿酒酵母的繁殖速度降低。研究AT4G12490基因在拟南芥开花调控网络中的功能将为通过基因工程技术延长植物营养生长时间和增加生物量积累水平提供理论根据,在生物质能源开发中具有重要意义。对AT4G12490等EARLI1亚家族基因的抗性功能进行研究,在农作物改良方面具有潜在的应用价值。
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