ERAD复合体重要组分HRD1调控拟南芥种子大小及萌发后生长的机理研究

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植物生长发育的很多过程,都是通过一种选择性的删除调控蛋白的机制来实现的。一条非常重要蛋白质降解通路包含了一个含有76个氨基酸的小蛋白泛素(Ubiquitin)和2-MDa的26S蛋白酶体复合物,这个系统被称为泛素/26S蛋白酶体系统(Ubiquitin/26S Proteasome System,UPS)。所有的膜蛋白质和分泌性的蛋白质都要经过内质网进行修饰和折叠,最终完成折叠发挥功能。内质网内蛋白质的折叠过程受到内质网质量控制系统监控(ER Quality Control,ERQC)。在内质网中未能完成正确折叠的蛋白质或受损伤的蛋白需要通过内质网相关降解机制完成降解(ER-AssociatedDegradation,ERAD)。在酵母和哺乳动物中,ERAD机制及组分已经研究的比较透彻,酵母中存在Doa10p和Hrd1p两大复合体。但是,在植物中针对ERAD的组分及作用机理研究甚少。本研究主要关注的是与酵母Hrd1p同源的HRD1基因,在拟南芥中存在两个结构上与Hrd1p同源的基因HRD1A和HRD1B。通过体外泛素化实验证明HRD1A和HRD1B都具有泛素连接酶活性。而在烟草叶片中瞬时表达融合GFP标签的HRD1A-GFP和HRD1B-GFP蛋白,确定它们门与内质网定位Marker蛋白HDEL-RFP呈现出很好的重叠信号,从而表明两者都具有内质网定位模式。在内质网胁迫诱导剂衣霉素处理hrd1a/hrd1b双突变体后,极强的诱导了UPR相关基因的表达。  统计数据表明,hrd1a/hrd1b双突变体与野生型和两个单突变体相比种子体积显著变小,通过检测种子发育过程中的参与调控种子大小相关基因的表达情况发现,HRD1间接的反向调控了影响种子胚乳发育的含有AP2功能区转录因子AP2的表达,从而导致hrd1a/hrd1b双突变体种子胚的发育和胚乳细胞化周期明显提前,这也可能是hrd1a/hrd1b双突变体种子变小的原因。同时对干种子内部油脂定量和定性的分析发现,hrd1a/hrd1b双突变体干种子中油脂的含量明显降低。而作为油料作物种子中的主要的能量储存物质——油脂(TAG),其含量的降低可能直接导致成熟种子发生褶皱和变小的表型,更有甚者会引起由自身能量供给不足而造成的植物在种子萌发及萌发后幼苗的生长受到阻碍。在无糖培养上,hrd1a/hrd1b双突变体表现出了强烈的萌发后生长受到抑制的表型也证明了这一点。我们进一步检测了双突变体种子在发育期间油脂合成过程中的一些重要的限速酶类基因的表达。结果显示,在种子发育第六天,即油脂合成起始阶段,hrd1a/hrd1b双突变体内部油脂合成过程中的多个限速酶类基因如,DGAT1、GPAT和PAH1/2的表达量显著下降,这可能是导致油脂积累发生缺陷的关键原因,也最终引起了hrd1a/hrd1b双突变体种子萌发后生长受到阻碍的表型。  我们也模拟了在自然条件下储存不同时期的种子在土壤中的生长情况,与野生型相比,hrd1a/hrd1b双突变体种子的出土率受到了更加严重的影响,储存时间越长,出土率越低。这也可能与其内部能量物质油脂存储缺陷有关。HRD1调控油脂积累的研究将可能对农业生产实践具有重要的指导意义。
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