拟南芥光呼吸突变体筛选方法优化及pglp1-2突变体研究

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植物光呼吸(Photorespiration)代谢是一条流经多种细胞器且调控机理复杂的代谢途径。虽然光呼吸作用的过程消耗了植物一部分光合固定碳和能量,影响农作物的产量,但研究发现,光呼吸对植物的正常生长发育起着重要作用。因为光呼吸参与调控植物多种代谢和生物学过程,包括调节光合作用、维持细胞氧化还原状态等。然而由于光呼吸的复杂性,其对植物代谢网络的调控机理至今报道甚少。本研究以甲基磺酸乙酯(ethyl methanesulfonate,EMS)处理的拟南芥Columbia(Col-0)种子为实验材料,结合两种技术筛选光呼吸突变体。(1)叶绿素荧光成像技术,即光呼吸突变体在大气(400 ppm CO2)中的最大光化学量子效率(FV/Fm)比野生型Col-0小;(2)光呼吸突变体在不同气体条件下的表型,即突变体在大气中表现黄化矮小,而在高浓度CO2(3000 ppm CO2)环境中能正常生长。结合这两种方法,筛选到1株光呼吸突变体156-16。相比野生型,突变体156-16在正常大气条件下,初期表现出生长缓慢,植株整体明显矮小,叶片颜色偏黄,且后期无法正常开花结实;而在高浓度CO2条件下,突变体的生长形态与野生型无明显差异。通过基因定位和全基因组测序最终确定突变基因为PGLP1(Phosphoglycolate Phosphatase 1),基因号为AT5G36700。为了进一步证明是由该基因导致突变植株156-16表现出光呼吸表型,构建proPGLP1::PGLP1互补质粒,转化156-16,观察发现阳性转基因材料在大气中的生长状态恢复到野生型水平,由此将突变体植株156-16命名为pglp1-2。proPGLP1::GUS组织表达分析表明PGLP1在叶片、茎、花和果荚中均有表达,但在根中不表达。构建35S::PGLP1-GFP质粒转化Col-0,以转基因植株为材料游离原生质体,荧光分析表明PGLP1定位于叶绿体上,同时将35S::PGLP1-GFP质粒瞬时转化烟草,GFP荧光分析说明PGLP1定位于叶绿体上和细胞质中。比较分析了pglp1-2和PGLP1的T-DNA插入突变体pglp1-1在不同生长时期的表型,以及测定二者的PGLP酶活和游离磷含量。表型分析结果发现pglp1-2的表型相对于pglp1-1属弱光呼吸表型,即pglp1-1的突变体表型不能被高浓度CO2回补且无法在大气中长久存活。酶活和游离磷含量测定结果发现,大气中和高浓度CO2中生长的pglp1-2突变体和pglp1-1突变体的PGLP酶活均大概只有野生型的50%;而在高浓度CO2中和大气中生长的pglp1-2突变体和pglp1-1突变体的游离磷的含量与野生型无明显差别。综上所述,本研究前期通过结合叶绿素荧光成像技术和高低浓度CO2方法筛选光呼吸突变体,最后筛到光呼吸突变体156-16,经基因定位发现突变基因为PGLP1,PGLP1定位在叶绿体,与其T-DNA插入突变体pglp1-1相比,pglp1-2属于弱光呼吸突变体,该材料对于进一步研究PGLP1的多种生物学功能具有较好的价值。
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