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本实验室的研究已经证明低浓度的镉(<10 μM)可以诱导细胞自噬,而在高浓度镉刺激下细胞会发生凋亡。本实验采用细胞培养、透射电子显微镜、Western blot,倒置相差显微镜、激光共聚焦、流式细胞术等细胞生物学技术,以HEK 293T细胞为研究对象,研究分析了白藜芦醇与镉诱导的HEK 293T细胞自噬之间的关系；以镉诱导的自噬为前提,探究白藜芦醇与自噬体-溶酶体融合之间的关系；分析了白藜芦醇(RSV)的抗氧化性与镉诱导的自噬间的关系；探究白藜芦醇与镉诱导的细胞凋亡之间的关系。具体实验结果如下：1、白藜芦醇与镉诱导的HEK 293T细胞自噬的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔培养板中,随机分成对照组和试验组。试验组：①细胞暴露于40μM中24 h；②细胞用白藜芦醇(40 μM)预处理1小时后暴露于(0-10μM)镉中24 h；③选用40 μM白藜芦醇和5 mM 3-MA联合8和10μ镉处理HEK 293T细胞24 h。本试验采用透射电子显微镜观察自噬体与自噬溶酶体；Western blotting分析自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达量的变化；激光共聚焦显微镜分析GFP-LC3的点状聚集。结果显示,HEK 293T细胞暴露在镉后,发现细胞内自噬体数目明显增多。白藜芦醇能加强镉诱导的自噬,且在8和10μM时变化明显,加入自噬抑制剂3-MA后这种现象被抑制。提示：镉能诱导自噬,而白藜芦醇能够协同镉引起细胞自噬。2、白藜芦醇与镉诱导细胞自噬中自噬体-溶酶体融合的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中,选用40 μM RSV和/或5mM3-MA分别联合8和10μM Cd处理KEK 293T细胞24 h；选用40 μM RSV和/或3μM TG分别联合8和10 μMCd处理KEK 293T细胞24 h。利用Western blotting分析溶酶体标志蛋白cathepsin L、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达量；用激光共聚焦观察GFP-LC3和LAMP2的共定位。结果显示,在镉诱导的细胞自噬中,白藜芦醇能增强溶酶体的活性,而当自噬被抑制时溶酶体的活性也降低；加入自噬体溶酶体融合抑制剂TG以后,虽然增加了细胞的自噬能力,却降低了溶酶体的活性,而白藜芦醇未能改变这种结果。提示：白藜芦醇可能起作用的阶段是在自噬体溶酶体融合之前3、白藜芦醇的抗氧化性与镉介导的细胞自噬之间的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中。试验组：细胞用白藜芦醇(40州)预处理1小时后暴露于(0-10μM)镉中24 h；用40μM RSV和/或1μMEX-527分别联合10μM镉处理KEK 293T细胞24 h；用40μM RSV和/或1μM EX-527分别联合1 mM H2O2处理KEK 293T细胞24h。利用酶标仪检测活性氧ROS的表达量；Western blotting分析SIRT1蛋白、自噬标志蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达量；用激光共聚焦GFP-LC3和LAMP2的共定位。结果显示,随着镉浓度的增加ROS也增加,而加入白藜芦醇后ROS降低；白藜芦醇能激活SIRT1,而当SIRT1的表达量被抑制时,白藜芦醇对自噬的促进作用也减弱。提示：白藜芦醇增强镉诱导的自噬可能都与其抗氧化性有关,而其中SIRT1起着重要的作用。4、白藜芦醇与镉诱导的细胞凋亡之间的关系HEK 293T细胞悬液(5×105)接种于6孔板中,适应性培养后,用40μMRSV、10μMCd、20μM Cd、10μM Cd+RSV和20 μM Cd+RSV分别处理HEK293T细胞。相应时间后用倒置相差显微镜观察细胞形态；Western blotting分析caspase-3的表达量；用流式细胞仪分析细胞凋亡数量。结果显示,HEK 293T细胞暴露于镉24 h后,细胞皱缩变形甚至死亡,而加入白藜芦醇后,细胞形态改变被抑制；镉诱导了caspase-3表达量增加,而加入白藜芦醇后被降低：镉诱导细胞凋亡可以被白藜芦醇阻滞。提示：白藜芦醇能抑制镉诱导的细胞凋亡。本研究在低浓度镉(0～10μM)诱导自噬的基础上进行。白藜芦醇能增强镉诱导的细胞自噬,而其作用阶段可能是在自噬体溶酶体融合之前,而且可能与白藜芦醇的抗氧化性有关,SIRT1可能在其中扮演着重要的角色,白藜芦醇还能抑制镉诱导的细胞凋亡。