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实验背景:肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的一种恶性肿瘤,在全世界范围内,亦是发病率和致死率最高的肿瘤之一,其致死率在肿瘤疾病中位居第三位。虽然近年来使用早期诊断、化疗、放疗和手术治疗等方法使肝癌的疗效有一定的提高,但是肝癌患者的预后仍不理想。多胺是一类带正电荷的小分子脂肪族化合物,包括腐胺(putrescine,Put)、亚精胺或精脒(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm),是生命活动中不可或缺的生命物质,具有广泛的生理及病理生理作用,如促进细胞分裂增殖、分化以及凋亡等。最近有文章显示体内多胺含量的变化和Akt1的高表达密切相关,但是在肝癌中多胺和Akt1的生物学功能及分子机制仍然不清楚。实验目的:多胺是一种带正电荷的小分子脂肪族化合物,包括腐胺(putrescine,Put)、亚精胺(spermidine,Spd)和精胺(spermine,Spm)。它广泛存在于自然界中,例如:动植物细胞、细菌、原核细胞、酵母菌和病毒中都含有一定的多胺,它是大多数生命器官天然组份中所必需的。在正常生理情况下,多胺在人体组织和体液中的含量非常少;而在病变的肿瘤组织中多胺的含量明显高于正常组织,并且肿瘤的生长、侵袭和迁移均与细胞内多胺的含量有关。本实验通过采用低、中、高三种不同浓度的多胺处理肝癌细胞,观察多胺微环境对肝癌细胞生长、迁移、侵袭等能力的影响,并探究其相关分子作用机制。实验方法:选取人肝癌细胞Hep G2和SMMC-7721作为研究对象,首先用基因转染技术把Akt1基因转入Hep G2细胞和SMMC-7721细胞中,将三种不同浓度的外源性多胺按低浓度(腐胺0.008 nmol/m L、精胺0.05 nmol/m L、精脒0.1nmol/m L)、中浓度(腐胺0.08nmol/m L、精胺0.5 nmol/m L、精脒1.0 nmol/m L)和高浓度(腐胺0.8 nmol/m L、精胺5.0 nmol/m L精脒10.0 nmol/m L)分别加入含定量培养基的Hep G2细胞、Hep G2-Akt1细胞、SMMC-7721细胞和SMMC-7721-Akt1细胞中。每一种细胞都设阴性对照组,培养15天和30天。采用细胞划痕实验和Transwell迁移实验(未铺胶)检测不同浓度的多胺对四种细胞迁移能力的影响;采用克隆形成实验检测不同浓度的多胺对四种细胞增殖能力的影响;采用蛋白免疫印迹实验(Western blot)检测Akt1、Akt、基质金属蛋白酶(MMP9)、鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarbo-xylase,ODC)、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、P27kip1、整合素(Integrinα6)、精脒/精胺乙酰转移酶(spermidine/spermine N1-acetyltransferase,SSAT)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等蛋白在不同浓度多胺微环境下的变化。实验结果:Hep G2细胞、Hep G2-Akt1细胞、SMMC-7721细胞和SMMC-7721-Akt1细胞在不同浓度多胺微环境下表现出不同的增殖、侵袭和迁移能力,并且随着多胺浓度的升高其增殖、侵袭和迁移能力逐渐增强,并且表现出时间剂量依赖性。蛋白免疫印迹实验结果表明多胺可通过诱导鸟氨酸脱羧酶(ODC)、精脒/精胺乙酰转移酶(SSAT)、Akt1、整合素(Integrinα6)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶(MMP9)、低氧诱导因子(HIF-1α)等蛋白的表达上调以及下调P27kip1蛋白表达促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。实验结论:高浓度多胺微环境促进Hep G2细胞、Hep G2-Akt1细胞、SMMC-7721细胞和SMMC-7721-Akt1细胞增殖、侵袭和迁移等能力,并且Hep G2-Akt细胞和SMMC-7721-Akt1细胞的增殖、侵袭和迁移能力明显高于Hep G2细胞和SMMC-7721细胞,表明Akt1于多胺微环境条件下在促进肿瘤迁移的过程中发挥着重要作用。