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【背景】据2012年Gl OBOCAN全球肿瘤统计,全球每年42.5%新发胃癌病例来自我国。45.0%胃癌病死人数来自我国。因此,胃癌对人类健康,尤其是国人健康存在极大的威胁。大多数胃癌患者对胃癌了解不足,缺少定期胃镜检查,在确诊时已处于中晚期,失去手术机会,化疗成为防止胃癌复发及转移的主要治疗措施之一。然而,耐药现象(Drug resistance)常常导致胃癌患者有药无用,甚至无药可用,最终导致化疗失败,预后极差。国内外研究同行及我们的多项研究已经初步阐明了胃癌耐药的多种相关机制,然而胃癌耐药产生机制十分复杂,其根本机制仍有待进一步阐明。因此,从新的角度阐明胃癌耐药的机制可为胃癌耐药研究提供新的思路。自噬(Autophagy)是细胞通过消化自身,清除胞内受损蛋白和细胞器的重要机制,与肿瘤发生发展具有不可分割的联系。有部分研究认为自噬能够通过自噬性死亡抑制肿瘤发生,然而越来越多的研究提示自噬能够被肿瘤细胞利用,成为肿瘤在各种恶劣情况下存活的重要方式。那么,化疗药物能否诱导自噬发生,化疗药物作用情况下,自噬能否促进胃癌细胞的存活,什么关键分子或者通路在其中发挥关键调控作用?其调控机制如何?既往研究发现m TOR是自噬调控的关键通路,尤其是m TORC1下游的转录因子TFEB是在转录水平调控自噬的关键分子,其调控的细胞自噬在脂质代谢紊乱、帕金森等多种代谢蓄积性疾病中发挥关键调控作用。然而,TFEB在肿瘤中所扮演的角色尚不明确。那么,TFEB是否参与胃癌恶性表型,尤其是胃癌耐药?TFEB是否通过调控胃癌细胞自噬促进胃癌耐药?其机制如何?目前尚不明确。【目的】1、明确在化疗情况下,自噬水平的变化情况及其对胃癌细胞存活的作用;2、探讨化疗情况下,自噬关键分子信号通路m TORC1/TFEB的变化情况;3、阐明自噬关键转录调控分子TFEB在胃癌耐药中的关键作用及其调控机制。【方法】1、利用western blot、MDC染色、RFP-GFP-LC3腺病毒转染、电镜等方法在体外检测化疗情况下胃癌细胞自噬水平的变化;2、利用免疫组化检测LC3,观察化疗药物对裸鼠成瘤瘤体的自噬水平的影响;3、利用MTT药敏实验、凋亡检测等方法在体外验证化疗情况下自噬对胃癌细胞存活的作用;4、利用裸鼠成瘤实验在体内验证化疗情况下自噬对胃癌细胞存活的作用;5、利用western blot、免疫荧光方法观察自噬关键通路m TORC1/TFEB信号通路的变化;6、利用免疫组化观察转录因子TFEB在胃癌中的表达情况和亚细胞分布;7、运用MTT药敏实验、凋亡、高内涵分析等相关分子生物学检测技术,研究TFEB通过调控其下游靶基因Lamp1等分子,促进胃癌细胞在化疗情况下存活的关键作用及调控机制。【结果】1、自噬是胃癌细胞在化疗药物作用情况下的一种重要存活机制(1)化疗药物EPI和CIS能够诱导胃癌细胞发生自噬化疗药物表柔霉素(EPI)和顺铂(CIS)能够诱导LC3II表达增高,并促进p62的降解;而具有溶酶体抑制作用的抗疟疾药物氯喹(CQ)、液泡型ATP酶抑制剂BAF能够抑制EPI诱导的自噬流。MDC染色结果显示EPI能够使酸性囊泡增加;RFP-GFP-LC3腺病毒感染后,免疫荧光结果显示EPI能够自噬体(RFP+GFP+)明显增加,溶酶体抑制剂CQ能够促进EPI诱导的自噬体增加;电镜显示EPI能够诱导胃癌细胞内双层膜结构的生成;体内实验也表明,腹腔注射EPI能够使裸鼠荷瘤的瘤体LC3表达增高。(2)抑制自噬能够提高胃癌细胞对化疗药物EPI和CIS的敏感性MTT结果显示,利用溶酶体抑制剂CQ抑制胃癌细胞的自噬作用,能够增加胃癌细胞对EPI和CIS的敏感性;凋亡实验显示联用CQ+EPI能够显著增加EPI诱导的胃癌细胞凋亡。体内实验表明CQ+EPI联用能够明显降低裸鼠荷瘤瘤体的体积和重量。2、mTORC1/TFEB调控通路是化疗药物诱导自噬的关键转录调控通路(1)化疗药物能够抑制mTORC1EPI和CIS能够以时间依赖的方式抑制m TOR分子Ser2448位点的磷酸化;与此一致,m TORC1下游的p70S6K分子Thr389位点的磷酸化也明显受到抑制;(2)化疗药物能够诱导m TORC1下游转录因子TFEB入核发挥转录作用Western blot显示EPI能够以时间依赖的方式促进TFEB的去磷酸化;免疫荧光显示EPI能够诱导TFEB发生核转位;通过分离核浆蛋白,我们发现随着EPI处理时间的延长,胞浆定位的TFEB表达逐渐降低,而胞核定位的TFEB表达逐渐增加;免疫共沉淀显示m TOR、Raptor、YWHA在正常情况下能够与TFEB结合,而EPI作用下与TFEB的结合能力逐渐减弱。(3)免疫组化结果显示胃癌组织中TFEB表达明显比癌旁组织增高,且主要表达于胃癌细胞的胞核中,并与胃癌的不良预后相关;3、TFEB通过调控自噬和Lamp1介导的溶酶体功能,促进胃癌细胞的存活(1)过表达TFEB能够自噬发生和溶酶体生成,促进胃癌细胞的存活MTT结果和凋亡实验证实过表达TFEB及其S11A突变体能够降低化疗药物EPI诱导的凋亡,促进胃癌细胞存活。TFEB能够促进自噬,并转录激活Lamp1等溶酶体相关分子表达。(2)干扰TFEB表达能够抑制化疗药物诱导的自噬,提高化疗敏感性抑制TFEB在胃癌细胞中的表达能够胃癌细胞的化疗敏感性;抑制TFEB表达能够明显抑制EPI介导的LC3 II增高和p62降解;同时明显抑制EPI介导的细胞中的平均Lysotracker数目增加;在胃癌阿霉素耐药细胞7901/ADR中抑制TFEB的表达能够显著提高其药物敏感性;(3)TFEB通过调控Lamp1介导的溶酶体功能,促进胃癌细胞对化疗的抵抗MTT结果和凋亡实验证实抑制Lamp1能够显著增加胃癌细胞对化疗药物的敏感性。Western blot和免疫荧光结果抑制Lamp1能够反馈性促进EPI诱导的TFEB核转位。【结论】本研究发现自噬对化疗情况下胃癌细胞的存活具有重要保护作用,抑制自噬能够增加胃癌的化疗效果;m TORC1/TFEB通路是调控自噬的重要通路,是化疗药物相关自噬的关键转录调控途径。TFEB作为m TOR下游的重要的自噬转录水平调节因子,在胃癌组织中表达明显升高,且主要表达于胞核,其表达水平与胃癌预后密切相关;化疗药物EPI和CIS等通过抑制m TORC1,促进TFEB发生去磷酸化,去磷酸化的TFEB能够发生核转位并发挥其调控自噬与溶酶体生成的转录活性。TFEB通过转录调控自噬和Lamp1介导的溶酶体功能,促进胃癌细胞在化疗情况下的存活。