美国中西部大豆孢囊线虫抑制性土壤研究

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大豆孢囊线虫是大豆减产的主要病原物之一。它的防治措施主要有轮作、抗线品种和杀线剂的使用,但是这些防治措施在一定程度上又受到了自身的限制。大豆孢囊线虫抑制性土壤在美国以及世界一些大豆主产区都有报道,但它的形成机制尚未完全被诠释。  本研究首先调查在农业生产方式和生物杀灭剂作用下大豆孢囊线虫抑制性土壤抑制水平的变化,同时分离出可能与抑制性有关的大豆孢囊线虫的寄生、抗生和捕食性真菌;然后运用高通量测序技术,全面调查根际土壤、游离土壤和孢囊中细菌和真菌种群多样性和结构,在此期间还优化了一种土壤处理方法用于温室检测抑制性土壤。从2009年到2012年,在美国明尼苏达州Waseca县的两块抑制性土壤中开展本研究。大田为裂区设计,整区处理为传统型耕作和免耕,裂区处理为:玉米-大豆轮作、大豆连作加细菌杀灭剂链霉素、大豆连作加真菌杀灭剂Captan、大豆连作加广谱生物杀灭剂福尔马林和大豆连作无杀灭剂处理。每年分别在播种期、生长中期和收获期采样。研究结果表明,耕作制度几乎对大豆孢囊线虫的密度和大豆产量没有影响。单年轮作并不能长期控制线虫密度,但是在轮作玉米后种植一年抗线品种能较好的控制线虫密度。生物杀灭剂中福尔马林最显著的增加了大豆孢囊线虫的种群密度。在四年内,大豆孢囊线虫二龄幼虫的平均寄生率为12.9%,免耕处理下2009年的播种期和2011年的收获期有较高的二龄幼虫寄生率。在轮作下二龄幼虫的真菌寄生率持续下降,生物杀灭剂对寄生率没有一致的影响,福尔马林只在某些采样时期降低了二龄幼虫的寄生率。从二龄幼虫上分离频率最高的真菌是Hirsutella rhossiliensis。卵的真菌寄生率总体很低,各处理间也没有显著差异,从卵上分离频率最高的是一类不能鉴定的真菌。捕食真菌的含量也没有受到各处理的影响,从土壤中分离到的捕食真菌大多数属于Arthrobotrys,其中47%为A.oligospora、32%为A.conoides。以上的结果再结合温室实验中土壤的传导性说明生物因子在此土壤抑制性中发挥着重要的作用。紧接着2013年做进一步研究,在播种期和生长中期,分别从各小区采集游离土壤和孢囊,并在生长中期采集根际土壤。分别扩增细菌的16S rRNA V4区域和真菌的ITS1区域,在250 bp Illumina Miseq平台上测序。序列经过组装和处理后,与最新的数据库比较,提取并注释OTU。结果表明,游离土壤中细菌多样性最高,孢囊中细菌多样性最低。传统型耕作制度增加了细菌种群多样性,但对细菌种群的结构组成没有显著的影响。福尔马林没有影响细菌种群多样性,但显著改变了游离土壤和孢囊中细菌种群组成,明显增加了Proteobacteria一类细菌的丰度。轮作改变了根际土壤中细菌种群多样性和结构组成。而真菌对各处理有不同的反应,根际土壤真菌多样性最丰富,孢囊内真菌多样性最低,且孢囊真菌有约一半的序列不能归类到门。耕作制度和福尔马林对三种样品中真菌的丰富度和多样性都没有影响,只有轮作增加了游离土壤真菌多样性。真菌的结构组成在所有处理下都发生了显著的变化,且在孢囊中,福尔马林降低了某些对大豆孢囊线虫有抑制作用的真菌的相对含量。我们的研究表明细菌和真菌在抑制性土壤的形成中可能都发挥着重要的作用,其中分布较广泛的微生物丰度的改变会引起种群结构的变化,从而影响土壤的抑制性。  本研究通过一系列温度试验,找到了既能完全杀死土壤中的大豆孢囊线虫,又能保持土壤抑制性的方法。在第一个实验中,不同温度下分别处理孢囊、卵和含孢囊的土壤,其中热处理包括40℃、45℃、50℃和55℃,冷冻处理包括-20℃和-80℃。处理后测定了孢囊或卵内真菌生长率以及大豆孢囊线虫的繁殖力。第二个实验通过温度梯度测定了大豆孢囊线虫的致死临界温度。最后,经过温室实验检测土壤在处理后能否重新建立起抑制性。实验表明,经过50℃、55℃、-80℃处理,大豆孢囊线虫丧失了繁殖能力和活性,且48℃为它的致死临界温度。经冷冻处理,真菌和细菌的存活率都没有受到影响。在-80℃下冷冻24 h后即使只有5%的土壤被加入也能在温室中建立起抑制性。以上实验表明在-80℃下冷冻24 h既能杀死线虫又能保持土壤抑制性,此方法值得在线虫土壤抑制性检测中推广。
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