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食管癌是人类常见恶性肿瘤之一,寻找与食管癌发生发展密切相关的基因、并对之进行功能研究,是当前的主要研究方向之一。寡核苷酸微阵列比较基因组杂交(Oligo Array CGH)是近年来将传统比较基因组杂交原理与微阵列技术相结合而产生的一项新技术,可以在全基因组水平研究肿瘤细胞的拷贝数改变,有助于快速鉴定肿瘤中的变异基因。本研究应用Oligo Array CGH研究食管癌的染色体改变,并从变异发生频率较高的染色体区段寻找可能与食管癌发生发展有关的基因。
采用Agilent公司Human4×44K Oligo Array CGH芯片对15例Ⅱ期食管鳞癌组织标本的染色体改变进行了系统的分析,鉴定出一系列变异区段。其中高频扩增的染色体臂包括3q(81％)、8q(69％)、17q(44％)、19p(50％)、20q(63％)等；高频缺失的染色体臂包括3p(63％)、4p(44％)、5q(44％)、9p(56％)、18q(75％)、19q(56％)、21q(44％)等。扩增频率较高的染色体区段有3q26.2-3q27.3(81％)、8q24.13-8q24.2l(63％)、11q13.3(75％)等,缺失频率较高的区段有3p14.2—3p21.1(63％)、3p21.31-3p25.2(63％)、11q21—11q23.3(69％)、9p21.3(56％)等。
芯片结果显示3q26.2-3q27.3是扩增频率最高的区段(81％)。Protein Kinase C iota(PKCiota)基因位于该区段的扩增核心区,也发生了显著地扩增(11/15)。本组前期的荧光原位杂交结果提示,PKCiota基因在食管癌组织和多个食管癌细胞系中存在高频率的扩增,其编码的蛋白也在食管癌组织中高表达。PKCiota基因编码一种丝/苏氨酸激酶,属于PKC家族中的非典型性PKC(Atypical PKCs)亚型。其在肿瘤发生发展中的作用所知甚少。鉴此我们在食管癌中对其功能进行了研究。在食管癌细胞系的体外实验中,PKCiota敲降不影响细胞的增殖、平板集落形成、细胞周期进展及细胞凋亡,但可抑制细胞运动、软琼脂集落形成和抗失巢凋亡能力。体内实验显示,PKCiota表达降低可抑制裸鼠皮下瘤生长。
针对PKCiota影响食管癌细胞抗失巢凋亡能力这一现象,我们进一步探讨了其分子机制。发现PKCiota只影响AKT的活化,对ERK无影响,提示PKCiota的抗失巢凋亡作用与P13K-AKT通路有关。而且,我们发现PKCiota在悬浮状态能够调节另一抗失巢凋亡基因SKP2的蛋白水平,提示其通过调节SKP2行使抗失巢凋亡的功能。免疫共沉淀结果显示二者没有相互作用,RT-PCR结果显示悬浮状态下PKCiota对SKP2的mRNA水平也没有影响,表明PKCiota可能在转录后水平或通过其它基因间接对SKP2进行调节。
以上结果表明,Oligo Array CGH是一种研究肿瘤遗传学的有效方法,能够在全基因组水平鉴定肿瘤的DNA拷贝数改变,有助于发现肿瘤相关基因。染色体3q26上的PKCiota基因,通过发生扩增和过表达,提高食管癌细胞的运动和抗失巢凋亡能力,是促进食管癌侵袭转移的重要癌基因。