【摘 要】
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紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是我国最重要的牧草资源,有“牧草之王”的美称。随着畜牧业的快速发展,培育紫花苜蓿新品系以适应我国不同地区个性化的环境需求仍然是目前亟待解决的问题。基因编辑育种周期短,能实现对作物性状的精准改良,已被广泛应用于不同植物的分子育种中。高效的遗传转化是高效的基因编辑体系的前提,而基因型是影响遗传转化的重要因素之一,目前紫花苜蓿的遗传转化体系已有报道,但适合
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紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是我国最重要的牧草资源,有“牧草之王”的美称。随着畜牧业的快速发展,培育紫花苜蓿新品系以适应我国不同地区个性化的环境需求仍然是目前亟待解决的问题。基因编辑育种周期短,能实现对作物性状的精准改良,已被广泛应用于不同植物的分子育种中。高效的遗传转化是高效的基因编辑体系的前提,而基因型是影响遗传转化的重要因素之一,目前紫花苜蓿的遗传转化体系已有报道,但适合西北地区种植的紫花苜蓿品种“公农1号”和“龙牧”遗传转化效率相对较低,仅为20%左右;且已报道的编辑技术可否在这两个品种中很好的利用仍未验证。因此,利用基因编辑对这两个本地品种改良仍然具有挑战。本研究以“公农1号”和“龙牧”两个紫花苜蓿品种为材料,分别优化和建立了根癌农杆菌和发根农杆菌介导的遗传转化体系,并建立了紫花苜蓿基因编辑体系。取得的主要结果如下:（1）探究了侵染条件和外植体选择对根癌农杆菌的侵染效率影响,结果表明:茎顶部叶片在超声15 min时侵染效率最高,达到了 70%。实验过程中发现“龙牧”这一品种转化效率低的瓶颈在于其分化效率极低。为了解决这一问题,拟通过选择再生效率高的单株进行后续转化提高再生效率。最终统计根癌农杆菌介导的“公农1号”和“龙牧”转化效率分别达到了 52.78%和 35.21%;（2）对“公农1号”和“龙牧”的无菌苗根茎叶和土培苗叶片4种不同外植体建立了发根农杆菌介导的遗传转化体系,研究表明土培苗叶片的毛状根诱导效果最佳。进一步,通过优化“公农1号”和“龙牧”的筛选条件,提高了基于毛状根转化体系的共转效率,结果表明1 mg/L草铵膦筛选压对紫花苜蓿叶片伤害不大,且筛选效果最优,统计发根农杆菌介导的“公农1号”和“龙牧”共转效率分别达到了 51.19%和51.5%;（3）在优化遗传转化体系的基础上,选定了 MsPALM和MsCOMT两个基因作为基因编辑的靶基因,旨在培育高产优质紫花苜蓿种质新资源。为了快速建立“公农1号”和“龙牧”两个紫花苜蓿品种的基因编辑体系,本研究首先利用先前建立发根农杆菌介导的遗传转化体系作为平台,分别验证了 tRNA系统、核酶系统、Cas12a系统和pHSE6401系统在毛状根中的编辑效率,筛选出了 pHSE6401为最优的编辑体系,编辑效率达到61.9%,且成功获得了MsPALM敲除的纯合编辑毛状根系。本研究还对紫花苜蓿的多个MsU6启动子进行了克隆,旨在利用其提高guide RNA的表达而达到提高紫花苜蓿的基因编辑效率的目的,为进一步优化紫花苜蓿基因编辑提供了思路。综上所述,本研究建立和优化了紫花苜蓿品种“公农1号”“龙牧”的遗传转化体系,初步筛选出了适合上述两个品种紫花苜蓿的基因组编辑体系。另外,还获得了潜在提高紫花苜蓿产量的基因编辑根系,为今后通过基因编辑快速精准改良本地紫花苜蓿重要农艺性状提供了研究思路和技术支持。
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