论文部分内容阅读
1目的本课题以卵蛋白(OVA)致敏和攻击复制豚鼠哮喘模型,探讨冷哮丸对豚鼠哮喘模型在乙酰胆碱(Ach)激发后所致呼气阻力和气管螺旋条对组织胺反应性的影响；外周血和肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(EOS)数量、肺组织形态学观察；以及对血清免疫球蛋白E(IgE),血清和BALF中IL-4、IL-5、一氧化氮(NO)、内皮素-1(ET-1)等指标的影响,从免疫反应、气道炎症反应、气道重塑和气道反应性等方面探讨该方的平喘作用机制。2方法2.1材料2.1.1实验动物：普通级豚鼠60只,雄性,体重250±50g,湖北省实验动物研究中心提供,实验动物许可证号：SCXK(鄂)2008—0005。2.1.2药剂制备：冷哮丸由麻黄、生川乌、细辛、蜀椒、白矾、牙皂、半夏曲、陈胆星、杏仁、甘草、紫菀、款冬花共12味中药组成,按1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：2：2比例,加10倍量的水煎煮2h,医用纱布过滤,滤渣加入6倍量的水煎煮1h,过滤,两次滤液合并,低温放置24h,过滤并水浴浓缩至原生药含量1.6g/m1,置低温冰箱中(4℃)备用。由湖北中医药大学国医堂制剂室制备。地塞米松片,0.75mg/片。临用时以蒸馏水稀释至相应药物浓度灌胃。剂量：地塞米松1mg/g;中药冷哮丸小剂量组4mg/g;中药冷哮丸中剂量组8mg/g;中药冷哮丸大剂量组16mg/g。2.1.3主要试剂：卵白蛋白(OVA), Sigma公司；乙酰胆碱,上海科丰化学试剂责任公司；磷酸组胺,上海喜润化学工业有限公司；IgE放免试剂盒,北方生物技术研究所生产；NO测定试剂盒,南京建成生物工程研究所；豚鼠IL-4试剂盒,豚鼠IL-5试剂盒,深圳晶美生物工程有限公司；ET-1放免试剂盒,北京东亚放射免疫所。2.1.4主要仪器：JSC-OK双头式多功能型超声波雾化器；RJE压力换能器；LMS-2B型二道生理记录仪；DH-140型动物人工呼吸机；ThermoLabsystems Multiskan MK3酶标分析仪；722型光栅分光光度计；Olympus BX50F-3双显微镜(含自动照相装置NikonE990)；VEX380型-80℃低温冰箱。2.2方法2.2.1动物模型复制以卵蛋白致敏和攻击复制豚鼠哮喘模型。实验第1天,配制100g/L卵蛋白生理盐水,豚鼠腹腔注射1ml卵蛋白生理盐水以致敏；第15天将致敏豚鼠置于15升透明玻璃罩内,给予1%卵蛋白生理盐水雾化吸入。以后每隔24h以1%卵蛋白生理盐水诱喘,共4次。正常对照组用同样方法以等量生理盐水进行腹腔注射及雾化吸入。2.2.2动物分组将豚鼠随机分为6组：①正常对照组,②哮喘模型组,③西药对照组(地塞米松治疗组),④冷哮丸大剂量组,⑤冷哮丸中剂量组,⑥冷哮丸小剂量组,每组10只。2.2.3实验检测项目2.2.3.1实验一冷哮丸对哮喘豚鼠气道反应性的影响。①一般情况观察：包括各组豚鼠的行为、饮食、体重、排便、皮毛及死亡等情况。②乙酰胆碱(Ach)支气管激发试验：于第23 d治疗结束后2h,用3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉,仰面固定于木板上,切开颈部皮肤暴露颈静脉及气管,用静脉留置针行颈外静脉穿刺置管,行气管切开、气管插管,连DH-140型动物人工呼吸机行辅助通气。每只豚鼠分别给予成倍增加的乙酰胆碱(0、12.5、25、50、100、200μg/kg),每次进液量200μ1,两个相邻给药点间隔5min。采用AniRes2003动物肺功能分析系统连续动态测定呼气阻力(expiratory resistance, Re),计算各给药时间点的Re与基础的Re比值(以百分数表示),以Re的变化代表气道反应性。③组织胺气道反应性测定：豚鼠麻醉后,纵向剪开颈部皮肤及皮下组织,暴露气管,取中段气管软骨环,剪开形成3 mm宽的气管螺旋条。用细线将螺旋条一端固定于浴槽底部,另一端连与压力换能器。对螺旋条施以2g的起始张力,平衡1h后,间隔2-3min依次加入10-6-10-3mol/L的组织胺进行刺激,连续记录气管螺旋条的张力变化。2.2.3.2实验二冷哮丸对哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS数量及肺组织形态学的影响。于第23d麻醉动物,分离颈动脉,取颈动脉血lml作白细胞分类和EOS计数。其余全血离心,取血清,放置-20℃低温冰箱中保存待检。对采血后的豚鼠进行肺泡灌洗,并回收肺泡灌洗液(BALF),瑞氏染色后行EOS计数,肉眼及光镜观察豚鼠肺组织形态学变化。2.2.3.3实验三、四、五冷哮丸对哮喘豚鼠血清总IgE、血清和BALF中NO、IL-4、IL-5、ET-1的影响。按豚鼠IgE、NO、IL-4、IL-5、ET-1等相关试剂盒说明进行操作测定。2.3统计学方法数据均以x±s表示,采用SPSS17.0统计软件进行数据处理,组间数据比较采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。3结果3.1实验一：冷哮丸对哮喘豚鼠气道反应性的影响3.1.1一般情况结果：正常对照组豚鼠无任何不适反应,平均体重增加,毛色光泽。哮喘模型组豚鼠普遍精神较差,活动减少,反应迟钝,进食及饮水量明显下降,毛色失去光泽,出现不同程度的呼吸次数增加,张口等呼吸困难症状,在整个喂养过程中体重增加不明显。哮喘模型组1只豚鼠哮喘严重发作经抢救无效死亡。各用药组豚鼠情况均较哮喘模型组明显改善。3.1.2各组豚鼠在不同浓度Ach激发后Re增长率比较：在Ach浓度为50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg时,哮喘模型组Re的增长率与正常对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。在Ach浓度为50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg时,地塞米松治疗组、冷哮丸大、中、小剂量组与哮喘模型组Re的增长率比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。地塞米松治疗组与冷哮丸大剂量组之间,及其与正常对照组之间Re的增长率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3.1.3各组豚鼠气管螺旋条对组织胺的反应性比较：当浴槽中组织胺浓度达到10-5-10-3mol/L时,各组豚鼠气管螺旋条产生剂量依赖性收缩。哮喘模型组豚鼠气管螺旋条张力明显高于正常对照组(P<0.05)。地塞米松治疗组和冷哮丸大、中、小剂量组哮喘豚鼠的气管螺旋条对组织胺的反应性均降低,各个浓度组织胺所诱导的气管螺旋条收缩张力与正常组类似(P>0.05)。3.2实验二冷哮丸对哮喘豚鼠外周血和BALF中EOS数量及肺组织形态学的影响3.2.1冷哮丸对豚鼠血及BALF中EOS计数的影响各组豚鼠血及BALF中EOS计数结果表明：正常对照组豚鼠血及BALF中白细包总数(white blood-cell count, WBC)、EOS绝对值及百分比均较低,模型组豚鼠血及BALF中WBC、EOS绝对值及百分比显著增加,与正常组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。结果表明,哮喘可引起实验豚鼠外周血及BALF中炎性细胞总数,尤其是EOS增多,这是气道炎症反应的病理学基础。治疗组各组动物外周血和BALF中白细胞总数、EOS数与哮喘模型组比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01),其中地塞米松组和冷哮丸大剂量组EOS数与正常对照组比较,差异无统计学意文(P>0.05),而冷哮丸中、小剂量组EOS数与正常对照组比较,差异仍有统计学意义(P<0.05)。说明冷哮丸能较好地控制哮喘的气道炎症性反应,而且存在剂量依赖关系。3.2.2肺组织肉眼观察正常对照组：肺组织呈淡红色,表面光滑,组织柔软富有弹性。哮喘模型组：肺组织呈暗红色,表面呈颗粒状,组织膨胀明显,部分组织颜色加深。药物治疗各组肺组织介于前二者之间。3.2.3肺组织HE染色光镜观察正常对照组：豚鼠肺组织支气管黏膜上皮排列整齐,黏膜下层及外膜层次清楚,无炎症反应,管腔清洁完整无分泌物。哮喘模型组：支气管黏膜上皮可见局灶性脱落,黏膜下层明显充血水肿,EOS灶状浸润,内夹少许淋巴细胞、浆细胞。高倍镜下见黏膜杯状细胞增生,数量增多,平滑肌增生肥大。黏膜下层炎症细胞灶状浸润。地塞米松组：支气管管壁结构完整,黏膜上皮部分恢复正常,黏膜下层轻度充血水肿,管腔未见分泌物。冷哮丸大剂量组：支气管管壁结构基本完整,黏膜上皮部分恢复正常,黏膜下层水肿明显减轻,支气管管腔恢复正常,未见炎性渗出物。冷哮丸中剂量组：管腔内见少许脱落的上皮细胞,粘膜增生,基层轻度肥厚。黏膜下层见轻度充血水肿及少量炎症细胞,管腔内仍见炎性渗出物。冷哮丸小剂量组：支气管管壁结构层次清楚,黏膜上皮逐渐恢复,管腔内可见部分炎性渗出物。3.3实验三冷哮丸对哮喘豚鼠血清总IgE、血清和BALF中NO的影响3.3.1冷哮丸对哮喘豚鼠血清IgE含量的影响与正常对照组比较,哮喘模型组豚鼠血清总IgE含量升高,差异有显著统计学意义(P<0.01)。各治疗组血清总IgE含量较模型组均明显降低(P<0.01),各治疗组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。3.3.2冷哮丸对哮喘豚鼠血清和BALF中NO含量的影响哮喘模型组血清和BALF中NO含量明显升高,与正常对照组相比,差异有显著统计学意义(P<0.01)。给予地塞米松或不同剂量冷哮丸经治疗后,血清和BALF中NO含量均明显降低,与哮喘模型组比较,差异均有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。但治疗后,冷哮丸中、小剂量组血清和BALF中NO含量与正常对照组相比,差异仍有统计学意义(P<0.05)。3.4实验四冷哮丸对哮喘豚鼠血清和BALF中IL-4、IL-5的影响3.4.1冷哮丸对哮喘脉鼠血清和BALF中IL-4含量的影响哮喘模型组豚鼠血清和BALF中IL-4含量明显升高,与正常对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。各治疗组豚鼠血清血清和BALF中IL-4含量明显下降,与哮喘模型组比较,差异均有显著统计学意义.(P<0.01)。3.4.2冷哮丸对哮喘豚鼠血清和BALF中IL-5含量的影响哮喘模型组豚鼠血清和BALF中IL-5含量明显升高,与正常对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。各治疗组豚鼠血清和BALF中IL-5含量明显下降,与哮喘模型组比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。3.5实验五冷哮丸对哮喘豚鼠血清和BALF中ET-1的影响3.5.1冷哮丸对哮喘脉鼠血清和BALF中ET-1L含量的影响哮喘模型组豚鼠血清和BALF中ET-1含量明显升高,与正常对照组比较,差异有显著统计学意义(P<0.01)。各治疗组豚鼠血清和BALF中ET-1含量明显下降,与哮喘模型组比较,差异均有显著统计学意义(P<0.01),各治疗组间血清和BALF中ET-1含量比较,差异无显著统计学意义(P>0.05)。3.5.2对气道重塑的影响哮喘豚鼠支气管黏膜上皮局灶性脱落,黏膜下层明显充血水肿,EOS等炎症细胞灶状浸润,黏膜杯状细胞增生,数量增多,平滑肌增生肥大,显示哮喘模型组出现气道重塑病理改变。经冷哮丸治疗后,豚鼠的气道黏膜下层充血水肿,杯状细胞增生、平滑肌增生肥大等气道重塑病理也明显改善。4结论4.1以卵蛋白致敏加攻击方法,可以诱发豚鼠气道变态反应,成功复制哮喘豚鼠模型。4.2实验证实哮喘发病与风、寒、痰等密切相关。宿痰伏肺,遇寒触发,致气道挛急是哮喘发作的主要病机。4.3冷哮丸有温肺散寒,涤痰化饮,解痉平喘之功,对哮喘豚鼠有良好的治疗效果,其作用机制是多途径、多层次、多靶点综合作用的结果。4.3.1冷哮丸能明显抑制哮喘模型Ⅰ型变态反应。作用机制与冷哮丸降低血清：总工gE含量,下调IL-4、IL-5水平,抑制过敏介质的释放密切相关。4.3.2冷哮丸能有效控制哮喘豚鼠模型的气道炎症反应,作用机制与冷哮丸降低血及BALF中炎性细胞数量,减轻炎症浸润,并降低血清和BALF中IL-4、IL-5、NO水平有关。4.3.3冷哮丸能明显缓解哮喘模型气道重塑改变。作用机制与冷哮丸抑制气道炎症,阻断气道平滑肌和粘膜的增厚,降低血清和BALF中ET-1水平有关。4.3.4冷哮丸能明显降低哮喘模型气道高反应性。其作用机制与冷哮丸松弛气道平滑肌,控制气道炎症,抑制气道重塑等功能有关。