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乳腺癌是女性最常被诊断出的恶性肿瘤之一,也是癌症死亡的重要原因。乳腺癌在所有女性癌症病例中约占30%,在所有癌症死亡比例中占14%。与许多国家一样,乳腺癌已成为中国女性中最普遍的癌症,中国新发乳腺癌和死亡病例占世界总数的12.2%和9.6%。目前,手术治疗,放疗和化疗是乳腺癌的主要治疗方法,但有着各种严重的副作用,包括呕吐,恶心,脱发,骨髓抑制和血栓等。因此,有必要为乳腺癌患者开发具有较低副作用的新型抗癌药。人参属植物,作为传统的药用植物,已经受到了广大研究者的关注。人参皂苷是人参属植物的主要有效成分,有着多种生物学功能,如免疫调节、抗菌、抗疲劳、抗肿瘤等功效。人参皂苷Rk1是人参经过处理后生成的一种成分,具有抗胰岛素抵抗,抗炎和抗癌活性。然而,关于人参皂苷Rk1的抗乳腺癌作用的报道却很少。因此,本课题通过一系列的体内外实验来探究人参皂苷Rk1对乳腺癌细胞的抗增殖作用及其分子机制。1.通过单因素和响应面实验提高了二醇组人参总皂苷中人参皂苷20（S）-Rg3,Rk1和Rg5含量,响应面优化后最佳工艺条件为乙醇浓度91.16%,溶解时间42.31 min,沉淀3次,此时人参皂苷含量为86.84±2.20%,并通过制备型HPLC制备出了人参皂苷Rk1。采用CCK-8细胞毒性实验,从人肝癌细胞株SMMC-7221;人肺腺癌细胞株A549;人结肠癌细胞株Caco-2;人胃癌细胞株SGC-7901;人乳腺癌细胞株MCF-7和人三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231中筛选出人参皂苷Rk1对乳腺癌细胞抑制作用最显著。经过120μM人参皂苷Rk1处理48 h后,MCF-7乳腺癌细胞活力降为16.78±3.26%,MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞活力降为17.41±2.94%,而MCF-10A正常乳腺上皮细胞活力为86.15±2.39%,人参皂苷Rk1对乳腺癌细胞有着很强的细胞毒性而对正常乳腺上皮细胞基本没有毒性。与此同时,人参皂苷Rk1还能剂量依赖的促进乳腺癌细胞LDH的释放,120μM人参皂苷Rk1处理后使得MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞LDH的释放分别为对照组的6.95倍和6.18倍。此外,120μM人参皂苷Rk1处理后MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞克隆形成率分别为2.02±0.67%和2.27±0.70%。在体内实验中,人参皂苷Rk1不会引起荷瘤裸鼠体重的下降。人参皂苷Rk1对荷瘤裸鼠有着显著的抑瘤作用,20 mg/kg Rk1对MCF-7乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤率为68.31%,对MDA-MB-231三阴性乳腺癌荷瘤裸鼠抑瘤率为66.40%。H&E染色结果表明人参皂苷Rk1能明显抑制乳腺癌细胞的生长并且与溶剂对照组相比较,对乳腺癌荷瘤裸鼠的心、肝、脾、肺和肾没有明显损伤。此外,人参皂苷Rk1组与对照组之间谷草转氨酶,谷丙转氨酶和肌酐水平无显着差异,表明荷瘤裸鼠肝肾功能未受损害。2.通过细胞周期分布检测、Hoechst 33342荧光染色、Annexin V/PI双染、线粒体膜电位检测、qRT-PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化等实验来探究人参皂苷Rk1对乳腺癌细胞的周期分布以及细胞凋亡的影响。实验结果表明,人参皂苷Rk1能阻滞MCF-7乳腺癌细胞于S期,120μM人参皂苷Rk1处理后S期细胞比例为60.44±1.88%。人参皂苷Rk1能阻滞MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞于G0/G1期,120μM人参皂苷Rk1处理后G0/G1期细胞比例为70.92±1.12%。在MCF-7乳腺癌细胞中,人参皂苷Rk1通过增加p21和p53蛋白水平,减少cyclin A和CDK2表达水平来对MCF-7乳腺癌细胞S期周期阻滞进行调控。在MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞中,人参皂苷Rk1通过上调p21和p53蛋白水平,下调cyclin D1和CDK4蛋白表达来对MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞G0/G1期周期阻滞进行调控。在细胞凋亡实验中,120μM人参皂苷Rk1处理后MCF-7乳腺癌细胞凋亡率为50.27±4.33%,是对照组的11.88倍,MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞凋亡率为54.87±3.96%,是对照组的8.95倍。此外人参皂苷Rk1降低线粒体膜电位,上调Bax水平,下调Bcl-2表达,促进细胞色素c的释放,激活caspases从而诱导MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡。在乳腺癌荷瘤裸鼠肿瘤组织中,人参皂苷Rk1也有着类似的功效,诱导肿瘤细胞凋亡,从而抑制瘤块的生长。凋亡抑制剂Z-VAD-FMK的使用,更加证明了人参皂苷Rk1是通过caspases的活化来诱导细胞凋亡。3.通过DCFH-DA染色、蛋白免疫印迹和免疫组化等实验来探究人参皂苷Rk1对乳腺癌细胞ROS/PI3K/Akt信号通路的影响。实验结果表明,人参皂苷Rk1能诱导MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞中大量产生ROS。蛋白免疫印迹表明人参皂苷Rk1对MCF-7和MA-MB-231乳腺癌细胞总的PI3K、Akt和mTOR表达没有影响,而抑制PI3K、Akt和mTOR的磷酸化。在乳腺癌荷瘤裸鼠体内动物实验中,人参皂苷Rk1也能抑制p-PI3K、p-Akt以及p-mTOR的表达,有着与体外实验一致的结果。PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002使用表明人参皂苷Rk1有着与LY294002类似的作用,PI3K/Akt信号通路激活剂胰岛素的使用更加证明了人参皂苷Rk1能通过抑制PI3K/Akt信号通路来诱导MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞死亡。ROS清除剂NAC的使用表明人参皂苷Rk1能通过ROS/PI3K/Akt信号通路诱导乳腺癌细胞死亡。此外,人参皂苷Rk1能抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞葡萄糖的摄取,乳酸的产生以及ATP的形成,抑制乳腺癌细胞中己糖激酶2,M2型丙酮酸激酶以及乳酸脱氢酶A的表达,从而抑制了乳腺癌细胞的有氧糖酵解,进而抑制乳腺癌细胞的生长与增殖。总而言之,本研究首次阐明了人参皂苷Rk1抗乳腺癌效应及其分子机制,为人参皂苷Rk1成为一种潜在的抗乳腺癌药物提供了基础实验依据和参考。