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柑橘黄龙病是一种具有毁灭性危害的细菌性病害，给柑橘的产业发展带来了极大危害。由于目前尚未在柑橘品种中找到对黄龙病有抗性的基因型，而基因工程育种具有效率高、周期短、可控性强等优点，因此利用基因工程技术开展柑桔黄龙病抗性育种受到了广泛的关注。抗菌肽，作为一种具有广谱杀菌活性的小分子物质，已被成功用于多种作物的抗病性研究。有离体研究表明，来源于柞蚕的抗菌肽对黄龙病病原菌有一定抗菌活性，然而，其在柑橘体内的抗菌活性有待研究。本实验室研究人员针对以上问题设计了由韧皮部特异启动子和组成型启动子调控Cecropin B（CB）抗菌肽基因表达的载体，经遗传转化得到转基因锦橙和血橙，由韧皮部特异启动子调控的的转基因株系共67个，其中RTBV（RT）37个，GRP（GR）30个，由组成型启动子（CaMV35S，CA）调控的转基因植株7个。 本研究利用上述转基因植株，通过嫁接黄龙病亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus）进行传毒试验，荧光定量PCR（qPCR）技术对黄龙病病原菌进行绝对定量，从而筛选出对黄龙病抗性增强的转基因植株。在此基础上，从抗菌肽基因的整合与表达特征（抗菌肽基因Southernblot分析、表达分析、RNA原位杂交、蛋白质原位杂交）来分析转基因植株抗性增强的可能机制，为进一步的研究提供参考，本研究主要结果如下： 1.病原菌含量分析用标准曲线的构建 为定量检测黄龙病病原菌在柑橘组织内的含量，本研究建立了以植物DNA为内参来检测黄龙病的绝对定量体系。来自黄龙病16s基因和来自柑橘的18s基因用于绝对定量体系的建立，在得到二者的标准品后，通过qPCR分析，得到黄龙病病原菌含量计算公式：每纳克植物 DNA含病原菌的量=10^(10.624-0.2718*CT16S)/10^(4.0531-0.2749*CT18S)。再通过 SPSS软件分析，筛选出与以非转基因植株为对照病原菌含量差异显著的植株。 2.抗性增强转基因植株的筛选 根据1所得的绝对定量公式，结合SPSS7.0软件分析，在嫁接传毒3个月后开始利用qPCR连续检测12个月，共得到7株对黄龙病抗性显著高于非转基因植株的转基因植株，其中，组成型启动子调控的转基因植株1株(JC-CA-10)，韧皮部特异启动子调控的6株。表型观察发现，韧皮部特异启动子调控的转基因植株于嫁接传毒8个月后开始陆续显症，JC-CA-10在嫁接传毒后20个月仍未有明显的症状，而非转基因植株在嫁接传毒6个月后就开始显症。 3.转基因植株中Cecropin B基因的表达及整合分析 提取抗性增强的转基因植株的RNA，反转录成cDNA，以actin为内参，非转基因植株为对照，qPCR结果表明，转基因植株的CB基因得到有效的表达量，组成型启动子调控的转基因植株其表达量显著高于韧皮部启动子调控的转基因植株。本试验通过Southern blot分析发现，抗性增强的植株JC-RT-5、JC-RT-25、XC-GR-14为单拷贝，JC-GR-32、JC-CA-10、JC-RT-3为两个拷贝，其中JC-RT-27为三个拷贝，拷贝数与抗性之间无必然相关性。 4.RNA原位杂交及蛋白质原位杂交 本研究通过RNA原位杂交和蛋白质原位杂交，分析了抗菌肽在植物组织中的富集情况。韧皮部特异启动子调控的转基因植株能有效的在韧皮部富集抗菌肽，而组成型启动子调控的目的基因则在所有组织部位都有表达，但目的基因产物主要富集于韧皮部中。抗菌肽在黄龙病病原菌寄生部位——韧皮部细胞——中的高效富集能增强转基因植株的抗性。