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研究背景与目的:
铅是对人体健康有害的重金属元素.主要损害神经、消化、造血、免疫系统和肾脏,可引起细胞一系列的功能变化.铅不仅具有神经毒性还具有免疫毒性,免疫系统是铅作用的重要靶器官之一.虽然人们对铅的免疫毒性作用已做了许多工作,但铅的免疫毒性机理尚未完全明了.铅吸收后进入血循环,约有95﹪的铅以不溶性磷酸铅稳定地沉积于骨骼系统,少量铅以磷酸氢铅、甘油磷酸化合物、蛋白复合物或铅离子(Pb<2+>)状态分布全身各软组织.有研究资料表明Pb<2+>可通过细胞膜离子通道进入细胞内,主要分布在细胞核和细胞浆以及线粒体、溶酶体、微粒体.众所周知,Ca<2+>在信号传导中起着极其重要的作用,Ca<2+>信号是淋巴细胞行使正常功能、识别抗原的关键性调节因素之一,细胞的多种功能受Ca<2+>信号调控,而多种胞外的信号也影响细胞内Ca<2+>信号,Ca<2+>信号失常会导致一系列病理过程.由于pb<2+>和Ca<2+>的离子半径较近似,而且都为二价阳离子,因此探讨Pb<2+>对淋巴细胞内Ca<2+>浓度([Ca<2+>]i)的影响是我们理解Pb<2+>免疫毒性的基础.细胞内[Ca<2+>]i的瞬间变化可触发许多胞内信号事件,大多数依赖Ca<2+>的细胞过程都是通过Ca<2+>结合蛋白而实现的,在众多的钙结合蛋白中,钙调素(Calmodulin,CaM)是最重要的一种,CaM存在于所有的真核细胞中,对Ca<2+>特别敏感,CaM本身没有酶活性,Ca<2+>通过与CaM结合,调节细胞内30多种靶蛋白或靶酶的活性,改变多种靶蛋白的构象,是细胞内Ca<2+>信号传导途径中的主要信号转导分子.淋巴细胞信号传导事件的结果是一系列特异性反应基因转录活化,这些转录事件诱导淋巴细胞分化和增殖.实验证明信号传导事件导致淋巴细胞增殖获得分化能力是受级联调控的一系列基因活化事件的结果.IL-2基因的活化是这种级联一个极好的代表,在大多数免疫应答中起关键作用,因此我们认为铅染毒对淋巴细胞分泌IL-2的影响,是铅免疫毒性的一个很重要结果.基于以上观点,我们认为在分子水平上,选择Pb<2+>对淋巴细胞[Ca<2+>]i、CaM、细胞增殖及分泌功能的影响是研究铅免疫毒性的切入点,是理解铅免疫毒性的基础.
第一部分 铅染毒对淋巴细胞[Ca<2+>]i的影响
研究目的:探讨不同浓度Pb<2+>染毒对静息及活化淋巴细胞[ca<2+>]i的影响.
研究方法 :
(1)研究对象:小鼠脾淋巴细胞悬液,共分4组,终浓度分别为10<-6>MPbCl:染毒组、10<-2>M PbCl<,2>染毒组、10<-2>M PbCl<,2>染毒组及对照组:
(2)采用Fura2-AM标记淋巴细胞[Ca<2+>]i,用荧光分析仪检测淋巴细胞[Ca<2+>]i的变化.
结论:
(1)Pb<2+>对淋巴细胞内[Ca<2+>]i的影响具有浓度、时间依赖性;
(2)10<-4>-10<-6>MPbCl<,2>染毒对淋巴细胞[Ca<2+>]i的影响具有可逆性:
(3)CaM参与了Pb<2+>对淋巴细胞[Ca<2+>]i影响的过程.
(4)氯离子及VDCC通道阻断剂对Pb<2>染毒引起淋巴细胞[Ca<2+>]i的变化无影响.
第二部 铅染毒对淋巴细胞内钙调素mRNA及钙调素蛋白表达的影响
研究目的：探讨不同浓度Pb2染毒对淋巴细胞CaMmRNA转录水平及蛋白表达水乎的影响，了解CaM转录水平与蛋白表达水平之间的相关性.
研究方法:
(1)研究对象:小鼠脾淋巴细胞悬液,体外给予不同浓度Pb<2>染毒.
(2)采用RT-PCR检测不同浓度pb<2>染毒后对淋巴细胞CaMmRNA表达水平的影响.
(3)采用免疫组化及Western blot检测不同浓度Pb<2>染毒后对淋巴细胞CaM的影响.
结论：
(1)Pb<2+>染毒淋巴细胞时,低浓度刺激CaMmRNA的表达,高浓度抑制表达;
(2)10<-4>MPbCl<,l2>染毒淋巴细胞时,抑制CaM蛋白的表达.
第三部分铅染毒对淋巴细胞增殖及分泌IL-2的影响
研究目的：探讨不同浓度Pb<2+>染毒对淋巴细胞增殖及IL-2分泌的影响.
研究方法：
(1)研究对象:小鼠脾淋巴细胞悬液,体外给予不同浓度Pb<2+>染毒.
(2)采用MTT法检测不同浓度pb<2+>染毒后对淋巴细胞增殖的影响.(3)采用ELISA法检测不同浓度pb<2+>染毒后对淋巴细胞培养上清液中IL-2的影响.
结论：(1)10<-4>-10<-5>M PbCl<,2>染毒对淋巴细胞增殖及IL-2分泌具有抑制作用;(2)10<-4>MPbCl<,2>染毒淋巴细胞后的细胞增殖指数与IL-2的分泌水平存在正相关.