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目的：
研究三邻甲苯基磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)诱发母鸡迟发性神经毒性(organophosphorus easter-induced delayed neurotoxicity,OPIDN)发生过程中,研究神经组织线粒体结构和功能的变化,分析时间-效应、剂量-效应关系,进一步探讨线粒体功能障碍与OPIDN发生发展的关系。
方法：
成年罗曼母鸡96只,随机分为四组:正常对照组,TOCp低剂量组(185mg·kg-1·bw)、中剂量组(375mg·kg-1·bw)和高剂量组(750mg·kg-1·bw),每组24只。TOCP溶解于玉米油中,按0.65mL·kg-1经灌胃一次性染毒,正常对照组给予等体积的玉米油。染毒后,观察各组母鸡的一般状况变化,定期测量母鸡体重,每天观察母鸡的OPIDN临床表现至实验结束,按8级评价神经毒性。在d1、d5、d15、d21时,处死动物,迅速取出大脑、小脑、脊髓和坐骨神经,用于测定线粒体功能。另取16只成年罗曼母鸡,随机分为TOCP组(n=12)和正常对照组(n=4)。TOCP组按750 mg·kg-1·bw剂量一次性灌胃给药,正常对照组给予等体积的玉米油。在d1、d5、d15、d21时,分别从TOCP组中随机选取3只母鸡,正常对照组随机选取1只,戊巴比妥钠麻醉,多聚甲醛灌注。取大脑皮层灰质及腰段脊髓前角组织戊二醛固定,修块,四氧化锇后固定。经乙醇梯度脱水后环氧树脂包埋,LKBⅢ型超薄切片机切片。醋酸铀和枸橼酸铅双重染色后,JME-1200EX型透射电镜观察线粒体结构的变化。采用梯度密度离心法提纯线粒体。通过测定线粒体悬液540nm处吸光度A540值的变化来检测线粒体膜通透性转换孔(mitochondriapermeability transition pore,MPTP)的开放情况;用荧光分光光度法测定线粒体跨膜电位的改变;利用萤光素酶生物发光法(firefly luciferase bioluminescence,FLB)检测实验动物在d1、d5、d15和d21各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经中ATP含量的改变;采用四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测各时间点大脑、小脑、脊髓、坐骨神经中线粒体呼吸链酶的活性的改变;采用RT-PCR法检测动物在各时间点大脑、脊髓、坐骨神经中ATPase6 mRNA水平的改变;采用SDS-PAGE和Western Blotting分析各组动物大脑、小脑、脊髓和胫神经中.ATPaseβ亚基蛋白表达的变化。
RT-PCR结果显示,大脑中,低、中、高三个TOCP组动物ATPase6 mRNA水平均比正常对照组降低(P＜0.05)。D21三组分别降低了34％、32％和23％(P＜0.01)。脊髓中,染毒TOCP后d1 ATPase6 mRNA水平即开始下降,其中高剂量组最明显,降低了33％(P＜0.01)。D21三组分别降低了23％、44％和35％(P＜0.01)。坐骨神经中,高剂量组变化较低、中剂量组更明显。D21时,三组ATPase6 mRNA水平分别降低了12％、20％和35％(P＜0.01)。
Western blotting显示,大脑中d1低剂量组ATPaseβ亚基蛋白含量没有明显变化,中、高剂量组分别升高了6.96％和8.75％(P＜0.05);d5低剂量组开始升高,中、高剂量组ATPaseβ亚基含量开始下降;d15低剂量组也开始降低,中、高剂量组进一步降低;d21三组分别比对照组降低了15.3％(P＜0.05)、27.9％(P＜0.01)和35.0％(P＜0.01)。小脑中,d1三个剂量组均出现明显降低,分别降低了11.3％(P＜0.05)、15.0％(P＜0.01)和16.5％(P＜0.05);d5三组ATPaseβ亚基含量进一步下降;d15低、中剂量组分别降低了21.3％和25.2％(P＜0.01),高剂量组有所升高;d21三组ATPaseβ亚基含量均较d15升高,但与对照组相比仍为降低,分别降低了17.5％(P＜0.05)、13.2％(P＜0.01)和5.35％。脊髓中,低剂量组d1没有明显变化,而中、高剂量组均比对照组升高;d5低剂量组开始升高,中、高剂量组则开始下降,分别降低了12.7％和21.0％(P＜0.05);d15后持续降低;至d21三组分别比正常组降低了22.7％(P＜0.01)、31.8％(P＜0.05)和43.9％(P＜0.01)。胫神经中,d1 ATPaseβ亚基含量就比对照组下降,分别降低了15.3％、25.1％(P＜0.01)和33.3％(P＜0.01);d5和d15 ATPaseβ亚基含量进一步降低(P＜0.05);d21低剂量组ATPaseβ亚基含量继续下降,中、高剂量组较d15有所升高,但与对照组相比还是明显降低,三组分别降低了30.6％、39.4％和50.4％(P＜0.01)。
结论：
1.TOCP诱导OPIDN的发生发展过程中,母鸡神经组织中的线粒体结构发生明显改变,变现为水肿、空泡化以及线粒体嵴减少、断裂和消失。
2.TOCP染毒后使母鸡神经组织线粒体膜通透性增加,线粒体膜电位下降,线粒体呼吸链酶的活性下降。
3.TOCP可使母鸡神经组织ATP含量降低,ATPase6基因表达下降,ATPaseβ亚基蛋白表达量下降。
4.线粒体功能障碍与Ops诱导的OPIDN发生密切相关。