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人类内源性逆转录病毒(Human Endogenous Retrovirus,HERV)是几百万年前感染人并整合到细胞基因组中、以孟德尔方式遗传至今的逆转录病毒的残余物,有98,000个片段和元件,约占人基因组的8%。HERV具有重要的生理功能,对于受精、胚胎着床和发育、基因转录等发挥重要的作用。HERV的表达也与疾病的发生发展相关,如癌症、自身免疫性疾病、精神性疾病、神经性疾病、慢性炎症、病毒感染等均与HERV的异常激活有关。目前,对HERV的认知还在起步阶段。本文针对人最常见的外源性逆转录病毒,人免疫缺陷病毒1型(Human Immubodeficiency Virus,HIV-1)的复制和整合与HERV有无相互作用、HIV-1的调控蛋白Tat是否可能激活HERV、我国HIV感染者中有哪些类型的HERV整合等科学问题,开展人内源性逆转录病毒K族(HERV-K)在我国HIV感染者中的分布、表达及激活因素研究。第一部分我国3个主要民族HIV感染者基因组中HERV-K113和K115基因分布研究HERV-K是整合最晚的一类HERV,HERV-K113和HERV-K115存在于部分个体的基因组中,具有全长HERV基因。目前仅有少数研究报道了关于它们在全球各国的分布,缺乏其在我国HIV感染者基因组分布的数据。目的:分析HERV-K113、HERV-K115基因在我国不同民族HIV感染者基因组中的分布,为进一步研究其与HIV感染和复制的关系奠定基础。方法:收集我国广西、云南、四川和河南等人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)感染者的血液样本,提取基因组DNA,PCR扩增HERV-K113和HERV-K115的整合前位点的上下游片段,根据电泳的扩增片段带型判断样本基因组中HERV-K113/K115基因插入状况。采用卡方检验和Fisher Exact Test等统计学方法分析HERV-K113/K115基因在不同民族、地区的HIV感染者中的分布是否存在差异。结果:共收集我国汉、彝、壮族3个民族共504份HIV感染者血液样本(汉族238例,彝族175例,壮族91例),检出151例HERV-K113插入和24例HERV-K115插入,均为杂合子插入,HERV-K113和HERV-K115的插入率分别为30.0%和4.8%;不同民族HERV-K113的插入率分别是39.6%(壮族)、30.3%(汉族)、24.6%(彝族);HERV-K115的插入率分别是7.7%(壮族)、5.0%(汉族)、2.9%(彝族)。HERV-K113的插入率在不同民族、不同地区有差异(p<0.05)。结论:首次获得HERV-K113和K115基因在我国不同民族HIV感染者基因组中频率分布的数据。第二部分不同人群外周血淋巴细胞(PBMC)中HERV-K RNA转录水平研究HERV-K是具有最完整病毒基因结构并且最活跃的HERV,能够产生有生物活性的逆转录病毒样颗粒。在HIV感染者血浆和PBMC中均发现HERV-K碎片。尽管在HIV感染者血浆中检测到HERV-K转录,但尚不清楚HERV-K RNA水平是否与HIV复制相关。目的:观察HERV-K RNA转录与HIV载量是否相关、HBV感染是否能够上调HERV-K RNA的转录以及HERV-K RNA转录在不同人群间有无差别。方法:收集未治疗的HIV感染者、抗病毒治疗后的HIV感染者、HBV感染者以及健康人的血液样本,提取纯化并鉴定PBMC总RNA有无基因组的污染,采用实时定量PCR的方法检测PBMC标本中的HERV-K RNA表达量,并检测HIV感染者血浆的HIV载量。采用方差检验和person相关检验等统计学方法分析HERV-K RNA转录与HIV载量是否相关、HERV-K RNA转录在不同人群间有无差别。结果:共收集68例研究对象的PBMC样本,排除提取纯化总RNA时发生基因组污染的7例,将61例纳入研究。除一例健康人的PBMC样本没有检测到HERV-K RNA外,其余PBMC样本均检出HERV-K RNA。未治疗的HIV感染者(16例)PBMC中HERV-K RNA水平显著高于接受治疗的HIV感染者、HBV感染者和健康人(p<0.05);接受治疗的HIV感染者(8例)、HBV感染者(21例)以及健康人(15例)的PBMC中的HERV-K RNA无显著差别。未治疗的HIV感染者血浆HIV-1载量与PBMC中HERV-K RNA水平无相关性(r=0.119,p=0.660>0.05)。结论:未治疗的HIV感染者中HERV-K RNA水平显著升高,但HIV-1载量与PBMC中HERV-K RNA水平无相关性。接受治疗的HIV感染者与HBV感染者和健康人的HERV-K RNA水平无显著差别。第三部分HIV-1Tat稳定表达细胞株构建及其激活HERV的研究反式转录激活因子(Trans-activator of transcription,Tat)蛋白是HIV编码的一种调节蛋白,与HERV LTR结合并调节HERVs及其下游基因的转录。但是,Tat蛋白能与哪些HERV LTR结合、影响哪些基因的转录以及这些基因有什么功能,尚不明确。目的:构建稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株,阐明Tat蛋白能激活哪些HERV转录以及被激活的基因具有哪些功能,为进一步研究HIV与HERV相互作用机制提供平台。方法:(1)构建稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株:采用半巢式PCR扩增HIV-1 B亚型和CRF01_AE亚型tat基因的两个外显子片段,无缝克隆法连接至p CDNA3.1(+)中。将构建的Tat表达载体和空载体转染入TZM-bl细胞,在含有G418细胞培养液培养两周。将筛选出来的细胞有限稀释至96孔细胞培养板,筛选出稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株。提取并纯化细胞株的DNA和总RNA,通过PCR扩增tat基因,通过RT-q PCR扩增tat m RNA以确定所选单克隆细胞中的tat整合并转录。(2)表达Tat蛋白细胞株的转录组测序和分析:对每个单克隆细胞株设3个生物学重复,提取细胞总RNA,构建c DNA文库,高通量测序,评估下机后的原始序列,将质量合格的序列比对到Ensembl数据库。采用RSe QC软件计算基因的表达量,使用DESeq2软件确定同一个基因在两个不同样本之间是否存在差异表达,并将差异表达基因比对到功能数据库进行注释。将差异表达基因比对到HERVd数据库,找到Tat调节的HERV基因,比较两种亚型Tat激活的HERV基因,还对部分感兴趣的测序结果进行了生物学验证。结果:两个HIV-1亚型的Tat蛋白均得到一株生长良好、细胞发光值为对照细胞的100倍以上的单克隆细胞株,并验证了稳定表达Tat蛋白的单克隆细胞株有tat基因的整合和转录。每个进行RNA测序的细胞样本均获得6.5G以上的数据,Q30均在90%以上,B亚型Tat蛋白调节54个HERV基因转录,其中30个上调、24个下调,大部分为LTR,仅8个有中间开放阅读框。CRF01_AE亚型调节58个HERV基因转录,其中38个上调、20个下调,大部分为LTR,仅8个有中间开放阅读框。B亚型与CRF01_AE亚型Tat均调节的有13个HERV。Tat蛋白与细胞生长和凋亡、细胞通讯、免疫性疾病、癌症、信号转导、感染性疾病、染色体结构、转录、细胞迁移、细胞应激反应等功能相关。转录组测序结果提示Tat与细胞生长相关,通过细胞增殖实验证明Tat蛋白表达不能促进TZM-bl细胞的生长。结论:成功构建了稳定表达HIV-1B和CRF01_AE亚型的Tat蛋白细胞株,鉴定了Tat蛋白调节的HERV基因,大部分为LTR。Tat调节的基因主要与细胞生长和凋亡、信号转导、转录、细胞迁移、细胞应激反应等功能相关。