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目的:分析mi R-146a-5p在人牙髓干细胞(Dental Pulp Stem Cells,DPSCs)与根尖牙乳头干细胞(Stem Cells from the Apical Papilla,SCAPs)中的表达情况,并探究其对DPSCs增殖,成骨和成牙本质向分化的调控作用及相关的分子机制。方法:(1)用免疫磁珠分选法筛选获得DPSCs与SCAPs。前期研究通过二代测序技术检测DPSCs和SCAPs中mi RNAs的差异表达,本研究用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证前期筛选出的7个mi RNAs(mi R-224-5p、mi R-1247-5p、mi R-3065-3p、mi R-452-5p、mi R-767-5p、mi R-4284、mi R-146a-5p)的表达差异。(2)qRT-PCR检测DPSCs在矿化诱导过程中mi R-146a-5p的表达量变化。(3)mi R-146a-5p过表达/抑制表达慢病毒稳定感染DPSCs,qRT-PCR检测慢病毒感染DPSCs后mi R-146a-5p的表达量。(4)对感染后的DPSCs进行矿化诱导,通过茜素红染色、碱性磷酸酶染色、ALP活性检测和成骨/成牙本质向分化相关基因(RUNX2,OSX,OCN,ALP及DSPP)检测鉴定细胞的分化功能。CCK8法检测慢病毒感染后DPSCs的增殖能力。(5)qRT-PCR检测DPSCs矿化诱导过程中NOTCH1和HES1的表达量变化。(6)DPSCs转染小干扰RNA(si RNA-NOTCH1)和小干扰RNA对照(si RNA-NC),q RT-PCR检测成骨/成牙本质向分化相关基因的表达,CCK8法检测DPSCs的增殖能力。(7)通过生物信息学方法对mi R-146a-5p进行靶基因预测,双荧光素酶报告基因实验结合q RT-PCR和Western Blot确认mi R-146a-5p与预测基因的靶向关系。结果:(1)mi R-224-5p、mi R-1247-5p、mi R-452-5p、mi R-767-5p、mi R-4284和mi R-146a-5p在SCAPs中的表达均低于DPSCs,其中mi R-146a-5p在DPSCs和SCAPs中的表达差异最大,而mi R-3065-3p表达无明显差异。(2)qRT-PCR结果显示mi R-146a-5p在DPSCs诱导分化过程中表达增高。(3)mi R-146a-5p过表达/抑制表达慢病毒感染DPSCs后mi R-146a-5p的表达水平显著上调/下调。(4)DPSCs过表达mi R-146a-5p后,钙化结节形成、碱性磷酸酶染色、ALP活性和成骨/成牙本质向分化相关基因表达增加,而增殖能力降低。抑制表达mi R-146a-5p,钙化结节形成、碱性磷酸酶染色、ALP活性和成骨/成牙本质向分化相关基因表达减少,而增殖能力增强。(5)qRT-PCR结果显示NOTCH1和HES1在DPSCs诱导分化过程中表达降低。(6)si RNA干扰NOTCH1基因后DPSCs中成骨/成牙本质向分化相关基因表达增加,细胞增殖能力降低。(7)生物信息学软件预测、双荧光素酶报告基因实验结合q RT-PCR和Western Blot证明了在DPSCs中mi R-146a-5p能与NOTCH1的3’UTR直接结合。结论:(1)mi R-146a-5p参与调控Notch信号,促进DPSCs向成骨细胞和成牙本质细胞分化并且抑制DPSCs的增殖能力。(2)推测低水平的mi R-146a-5p可能有利于人牙髓干细胞体外扩增时维持低分化状态,成为牙齿组织工程和牙髓组织再生中更好的细胞来源。