论文部分内容阅读
蟾酥是一种具有抗肿瘤作用的常用中药，其抗肿瘤的物质基础已被证明是以蟾毒灵(Bufalin)为代表的强心苷类成分。含有蟾毒灵的中药如华蟾素注射液等在临床常用于治疗肝癌、肺癌等实体瘤，并表现出较好疗效。在本课题中，我们以肝癌细胞和肺癌细胞为研究对象，进行蟾毒灵的细胞毒性作用相关机制的研究。 本课题的第一部分是肝癌细胞对蟾毒灵的细胞毒性作用的敏感性的研究。在考察蟾毒灵对SK-HEP-1、BEL-7402、SMMC-7721、Hep3B四种肝癌细胞株的细胞毒性作用中，不同肝癌细胞表现出不同的敏感性。其中，Hep3B细胞对蟾毒灵的敏感性相对较低，且该细胞对蟾毒灵衍生物BF211及其他强心苷类化合物也表现出低敏感性。我们拟通过比较不敏感细胞Hep3B和敏感细胞SK-HEP-1的差异，寻找肝癌细胞对蟾毒灵的细胞毒性作用的敏感性的影响因素。对Hep3B和SK-HEP-1的强心苷直接作用靶点Na+/K+-ATPase的表达和分布的分析结果表明，Hep3B细胞中Na+/K+-ATPase的α1和β1亚基均高表达，但是细胞膜上的α1亚基和Cav-1(caveolin-1)蛋皂在Hep3B细胞中的共定位程度低于SK-HEP-1细胞，提示Hep3B细胞的Na+/K+-ATPase信号复合体(Na+/K+-ATPase signalsome)的功能可能有缺失。比较两种细胞的转录组测序分析结果发现，有36个基因在两种细胞中差异表达，其中一个关键的基因可能是APOE(apolipoprotein E)。进一步实验证实，下调Hep3B细胞中APOE的表达可以影响Cav-1在膜上的分布，从而促进信号复合体的形成，PI3K/Akt/GSK3β信号通路对蟾毒灵的反应增强，提升Hep3B对强心苷的敏感性。此外，下调Hep3B细胞中Na+/K+-ATPaseβ1亚基的表达也可以增加细胞对蟾毒灵的敏感性，细胞间相互联结出现降解，提示Na+/K+-ATPaseβ亚基也可能通过参与细胞间相互作用影响细胞对强心苷类化合物的敏感性。 本课题的第二部分是对蟾毒灵在A549肺癌细胞中调节的靶点基因的寻找和生物信息学分析。比较蟾毒灵处理的A549肺癌细胞和对照细胞的转录组测序分析结果发现，差异表达基因的聚类分析结果中信号通路富集在凋亡通路、TNF信号通路、AP-1转录调节、MAPK信号等;可变剪接差异基因的翻译后蛋白网络构建结果则提示蟾毒灵对A549细胞的作用中可能含有对前体mRNA剪接、核糖体蛋白合成和蛋白酶体降解蛋白等功能的调节。热休克蛋白家族可能在蟾毒灵的作用机制中有重要的参与作用。蟾毒灵对凋亡等通路及热休克蛋白家族的调节作用与已有报道吻合。本实验室其他人员的工作则验证了蟾毒灵对A549细胞蛋白酶体的抑制作用。 综上所述，本课题的研究结果提示，Na+/K+-ATPase信号复合体在蟾毒灵对肝癌细胞的细胞毒性作用中起着关键的作用，细胞膜上信号复合体的分布以及细胞之间的黏附连接都可以影响肝癌细胞对蟾毒灵的细胞毒作用的敏感性;蟾毒灵作用于肺癌细胞后，不仅可以通过调节基因的表达水平从而诱导细胞凋亡等发挥细胞毒性作用，也可以通过调节基因的可变剪接表现出对蛋白酶体的抑制等作用。