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目的：
异丙酚是一种作用时间短且迅速的镇静催眠类药物，广泛应用于全身麻醉的诱导和维持，以及各种手术的镇静。异丙酚作用的分子机制多与γ-氨基丁酸(GABA)受体的活化、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)等受体以及其他离子通道相关。当给予临床剂量的异丙酚时，其副作用常与包括肌张力障碍和共济失调在内的运动障碍有关，提示异丙酚的应用会影响小脑神经环路的功能。小脑浦肯野细胞(PC)作为小脑唯一的传出神经元，接受来自爬行纤维(CF)的兴奋性输入，并在运动学习期间传递纠错信号、预测对小脑PC产生的负性事件、触发平行纤维(PF)-PC的长时程突触可塑性等。因此，CF-pC突触传递及可塑性在运动调节和运动学习中起着关键作用。虽然异丙酚的药理作用临床上已有较为广泛的研究，但它对小脑神经元的突触传递和可塑性的影响机制尚未明确。因此，通过电生理学实验记录和药理学方法探究异丙酚对CF-PC突触传递和长时程可塑性的影响，阐明异丙酚对离体小鼠小脑CF-PC的突触传递及长时程抑制可塑性的影响机制。
方法：
实验使用成年(4-6周龄)的ICR小鼠，异氟烷深度麻醉后，立即断头取脑。于人工脑脊液(ACSF)中进行冰敷，使用振动切片机制备300μm厚度的小脑皮质矢状面切片。开始试验记录之前，室温(24-25℃)下至少在充满95％O2和5％CO2的ACSF中孵育1小时。采用全细胞膜片钳记录小脑脑片中的浦肯野细胞，并使用尼康显微镜的60×水浸透镜进行观察。利用Axopatch700B放大器采集电生理数据，并通过Clampex10.4软件在电脑上用D/A数模转换器来获取。膜电压控制在-70mV左右，通过10ms，5mV的电压脉冲来模拟串联电阻，只有串联电阻稳定的细胞才会纳入分析。对于爬行纤维的电刺激，将含有ACSF的刺激电极放置在小脑颗粒层(GCL)中，记录的浦肯野细胞附近，采用0.05Hz的成对电流脉冲电刺激，直到在PC上记录到爬行纤维的全或无反应。对于CF-PC长时程抑制(LTD)的诱导，采用的是5Hz，30s的CF电刺激。在所有的实验中，ACSF中都加入picrotoxin(50μM)和saclofen(10μM)，以防止产生GABAA和GABAB受体介导的抑制反应。实验中所使用的药物均溶解于溶液中，以等分液的形式冷冻保存。使用时则将药物溶于ACSF，并以0.5ml/min的速度用蠕动泵灌流给药。实验结束后，将脑片固定在含4％多聚甲醛的0.1PBS(pH7.4)中24小时。在室温下用亲和素-生物素复合物(ABC Elite kit)孵育过夜。最后，用3，3二氨基苯并四氢氯化氢法检测生物毒素。电生理数据用clampfit10.3软件分析。所有数据均用均数±标准误表示。应用SPSS软件进行学生配对t检验和单因素方差分析，以确定各组数据之间的统计显著性差异。P值低于0.05被认为实验组和对照组之间具有统计学意义。
结果：
第一部分:
(1)电压钳模式下，阻断GABA能受体活性，异丙酚可以增加CF-PC兴奋性突触后电流(EPSCs)P1振幅和曲线下面积(AUC)，同时伴有双脉冲比值(PPR)的降低。异丙酚对P1振幅的增加作用具有浓度依赖性，其半数有效浓度(EC50)为20.9μM。
(2)阻断NMDA受体可显著降低P1振幅和AUC，显著增加PPR，并可消除异丙酚引起的CF-PC P1振幅和曲线下面积(AUC)的增加，以及PPR的降低。
(3)药理学激活NMDA受体可显著增强P1振幅和AUC，显著降低PPR，再给予异丙酚并未进一步增强CF-PC突触传递，P1振幅、AUC和PPR与单独使用NMDA相比没有显著差异。
(4)阻断突触后NMDA受体显著减弱，但没能完全阻断异丙酚诱导的CF-PC EPSCs P1振幅和AUC的升高，提示CF-PC突触后NMDA受体也参与了异丙酚诱导的CF-PC突触传递的促进作用。
第二部分:
(1)在5Hz，30s的CF刺激下，CF-PC产生长时程抑制，表现为P1振幅和AUC下降，PPR无明显变化。阻断mGluR1后，CF-PC LTD消失，其P1振幅、AUC和PPR与刺激前相比无明显变化。
(2)在记录电极内液中加入BAPTA以阻断突触后Ca2+后，未诱导出CF-PCLTD，诱导后其P1振幅、AUC和PPR与刺激前相比无明显变化。
(3)给予异丙酚后，增强了CF-PC LTD，表现为P1振幅和AUC较单独刺激时明显降低，PPR则无明显变化。
(4)阻断mGluR1对异丙酚导致的CF-PC LTD的增强作用无明显影响。与单独给予异丙酚相比，其P1振幅、AUC和PPR均无显著差异。
(5)在阻断mGluR1和NMDA受体的情况下，给予异丙酚后，CF-PC LTD消失。P1振幅、AUC和PPR与诱导前相比均无显著变化。
(6)在阻断mGluR1的条件下，药理学激活NMDA受体，诱发了CF-PC LTD，其P1振幅、AUC与单独阻断mGluR1相比明显降低。再给予异丙酚后，其P1振幅和AUC不再降低，PPR不变。
(7)在阻断mGluR1条件下，药理学激活NMDA受体并在电极内液中给予MK-801阻断突触后NMDA受体后，无法诱导出CF-PC LTD。其P1振幅、AUC和PPR与诱导前相比均无显著变化。
结论：
(1)在GABA能受体活性缺失条件下，异丙酚可通过激活NMDA受体增强小鼠小脑皮质CF-PC突触传递。
(2)低频刺激小脑爬行纤维可诱导出mGluR1依赖的CF-PC长时程抑制，而异丙酚可以通过激活突触后的NMDA受体来增强小鼠小脑CF-PC的长时程抑制。
异丙酚是一种作用时间短且迅速的镇静催眠类药物，广泛应用于全身麻醉的诱导和维持，以及各种手术的镇静。异丙酚作用的分子机制多与γ-氨基丁酸(GABA)受体的活化、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)等受体以及其他离子通道相关。当给予临床剂量的异丙酚时，其副作用常与包括肌张力障碍和共济失调在内的运动障碍有关，提示异丙酚的应用会影响小脑神经环路的功能。小脑浦肯野细胞(PC)作为小脑唯一的传出神经元，接受来自爬行纤维(CF)的兴奋性输入，并在运动学习期间传递纠错信号、预测对小脑PC产生的负性事件、触发平行纤维(PF)-PC的长时程突触可塑性等。因此，CF-pC突触传递及可塑性在运动调节和运动学习中起着关键作用。虽然异丙酚的药理作用临床上已有较为广泛的研究，但它对小脑神经元的突触传递和可塑性的影响机制尚未明确。因此，通过电生理学实验记录和药理学方法探究异丙酚对CF-PC突触传递和长时程可塑性的影响，阐明异丙酚对离体小鼠小脑CF-PC的突触传递及长时程抑制可塑性的影响机制。
方法：
实验使用成年(4-6周龄)的ICR小鼠，异氟烷深度麻醉后，立即断头取脑。于人工脑脊液(ACSF)中进行冰敷，使用振动切片机制备300μm厚度的小脑皮质矢状面切片。开始试验记录之前，室温(24-25℃)下至少在充满95％O2和5％CO2的ACSF中孵育1小时。采用全细胞膜片钳记录小脑脑片中的浦肯野细胞，并使用尼康显微镜的60×水浸透镜进行观察。利用Axopatch700B放大器采集电生理数据，并通过Clampex10.4软件在电脑上用D/A数模转换器来获取。膜电压控制在-70mV左右，通过10ms，5mV的电压脉冲来模拟串联电阻，只有串联电阻稳定的细胞才会纳入分析。对于爬行纤维的电刺激，将含有ACSF的刺激电极放置在小脑颗粒层(GCL)中，记录的浦肯野细胞附近，采用0.05Hz的成对电流脉冲电刺激，直到在PC上记录到爬行纤维的全或无反应。对于CF-PC长时程抑制(LTD)的诱导，采用的是5Hz，30s的CF电刺激。在所有的实验中，ACSF中都加入picrotoxin(50μM)和saclofen(10μM)，以防止产生GABAA和GABAB受体介导的抑制反应。实验中所使用的药物均溶解于溶液中，以等分液的形式冷冻保存。使用时则将药物溶于ACSF，并以0.5ml/min的速度用蠕动泵灌流给药。实验结束后，将脑片固定在含4％多聚甲醛的0.1PBS(pH7.4)中24小时。在室温下用亲和素-生物素复合物(ABC Elite kit)孵育过夜。最后，用3，3二氨基苯并四氢氯化氢法检测生物毒素。电生理数据用clampfit10.3软件分析。所有数据均用均数±标准误表示。应用SPSS软件进行学生配对t检验和单因素方差分析，以确定各组数据之间的统计显著性差异。P值低于0.05被认为实验组和对照组之间具有统计学意义。
结果：
第一部分:
(1)电压钳模式下，阻断GABA能受体活性，异丙酚可以增加CF-PC兴奋性突触后电流(EPSCs)P1振幅和曲线下面积(AUC)，同时伴有双脉冲比值(PPR)的降低。异丙酚对P1振幅的增加作用具有浓度依赖性，其半数有效浓度(EC50)为20.9μM。
(2)阻断NMDA受体可显著降低P1振幅和AUC，显著增加PPR，并可消除异丙酚引起的CF-PC P1振幅和曲线下面积(AUC)的增加，以及PPR的降低。
(3)药理学激活NMDA受体可显著增强P1振幅和AUC，显著降低PPR，再给予异丙酚并未进一步增强CF-PC突触传递，P1振幅、AUC和PPR与单独使用NMDA相比没有显著差异。
(4)阻断突触后NMDA受体显著减弱，但没能完全阻断异丙酚诱导的CF-PC EPSCs P1振幅和AUC的升高，提示CF-PC突触后NMDA受体也参与了异丙酚诱导的CF-PC突触传递的促进作用。
第二部分:
(1)在5Hz，30s的CF刺激下，CF-PC产生长时程抑制，表现为P1振幅和AUC下降，PPR无明显变化。阻断mGluR1后，CF-PC LTD消失，其P1振幅、AUC和PPR与刺激前相比无明显变化。
(2)在记录电极内液中加入BAPTA以阻断突触后Ca2+后，未诱导出CF-PCLTD，诱导后其P1振幅、AUC和PPR与刺激前相比无明显变化。
(3)给予异丙酚后，增强了CF-PC LTD，表现为P1振幅和AUC较单独刺激时明显降低，PPR则无明显变化。
(4)阻断mGluR1对异丙酚导致的CF-PC LTD的增强作用无明显影响。与单独给予异丙酚相比，其P1振幅、AUC和PPR均无显著差异。
(5)在阻断mGluR1和NMDA受体的情况下，给予异丙酚后，CF-PC LTD消失。P1振幅、AUC和PPR与诱导前相比均无显著变化。
(6)在阻断mGluR1的条件下，药理学激活NMDA受体，诱发了CF-PC LTD，其P1振幅、AUC与单独阻断mGluR1相比明显降低。再给予异丙酚后，其P1振幅和AUC不再降低，PPR不变。
(7)在阻断mGluR1条件下，药理学激活NMDA受体并在电极内液中给予MK-801阻断突触后NMDA受体后，无法诱导出CF-PC LTD。其P1振幅、AUC和PPR与诱导前相比均无显著变化。
结论：
(1)在GABA能受体活性缺失条件下，异丙酚可通过激活NMDA受体增强小鼠小脑皮质CF-PC突触传递。
(2)低频刺激小脑爬行纤维可诱导出mGluR1依赖的CF-PC长时程抑制，而异丙酚可以通过激活突触后的NMDA受体来增强小鼠小脑CF-PC的长时程抑制。