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非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)是核质大DNA病毒,能够感染家猪和各种野猪引起急性、出血性、烈性传染病,死亡率高达100%。2018年8月,我国报道第一例非洲猪瘟(African swine fever,ASF),随后一年内ASF迅速蔓延至中国大陆所有省份,给养猪业带来致命性打击。由于ASFV复杂的免疫逃逸机制和庞大的基因结构,目前还没有安全高效的商品化疫苗。天然免疫反应在宿主抗病毒感染中发挥重要作用,ASFV能够利用其自身编码蛋白拮抗宿主的天然免疫反应,逃避宿主的免疫监测。I型干扰素介导的抗病毒反应是宿主防御病毒感染的重要组成部分。据报道,ASFV多基因家族部分编码蛋白能够拮抗I型干扰素产生,阻碍其介导的抗病毒效应。12L是ASFV多基因家族360的成员,本研究重点围绕ASFV MGF360-12L蛋白拮抗I型IFN产生及抑制宿主蛋白与核转运蛋白相互作用的分子机制进行研究。为探讨ASFV MGF360-12L蛋白对I型干扰素产生的影响,通过荧光定量PCR和双荧光素酶检测系统分析IFN-βm RNA转录水平和荧光活性,结果显示,MGF360-12L能够抑制poly(I:C)诱导的IFN-β的表达。为探究MGF360-12L抑制IFN-β表达的分子途径,使用荧光定量PCR和双荧光素酶检测系统等分析了MGF360-12L对I型干扰素信号通路中关键细胞因子转录水平的影响以及对IFN-β转录增强子基因转录的影响。结果显示,MGF360-12L能够抑制I型干扰素信号通路中关键细胞因子ISG54、ISG56、TBK1、STING等基因的转录,同时也能够抑制IFN-β转录增强子NF-κB、IRF3和AP-1基因的转录水平,而且这种抑制作用呈现剂量依赖性。为进一步验证MGF360-12L抑制NF-κB的产生,探究MGF360-12L是否会抑制TNFα诱导的NF-κB,使用荧光定量PCR和双荧光素酶检测系统检测,结果均显示,MGF360-12L能够抑制TNFα诱导的NF-κB的产生,且呈现剂量依赖性抑制。为进一步阐明MGF360-12L对NF-κB信号途径的影响,利用间接免疫荧光、Western blotting、Co-IP等技术对经典核定位信号(NLS)、NF-κB亚基p50和p65的核定位、核运输蛋白表达及与MGF360-12L的相互作用等进行深入研究,结果显示,MGF360-12L能通过经典核定位信号(NLS)抑制NF-κB亚基p50和p65的核定位,但MGF360-12L并不会影响核转运蛋白的蛋白表达水平,进一步研究发现MGF360-12L与KPNA2、KPNA3、KPNA4存在相互作用,该相互作用抑制了p65与KPNA2、KPNA3、KPNA4的互作,从而竞争性抑制干扰NF-κB的核定位,同时荧光定量PCR结果显示,超表达KPNA2、KPNA3、KPNA4后,MGF360-12L抑制IFN-βm RNA的转录程度被缓解。随后为了探究MGF360-12L是否会影响TBK1及其磷酸化和IRF3及其磷酸的蛋白表达水平,以及是否会干扰p IRF3的核转运,使用Western blotting和核蛋白分析试验,结果表明,MGF360-12L降低了TBK1、pTBK1、IRF3、p IRF3的蛋白表达水平,抑制了p IRF3的核转运。综上所述,本研究结果表明MGF360-12L可以抑制IFN-I的产生,通过阻断宿主蛋白与核转运蛋白的相互关系抑制NF-κB的核易位,抑制IFN-β的表达,该研究为揭示ASFV逃避宿主天然免疫反应的提供了新的理论依据。