论文部分内容阅读
盘基网柄菌是一种简单的真核微生物，外形象阿米巴虫，通常称它为“社会阿米巴”，以吞食细菌为生。在营养丰富条件下，以单细胞形式存在并通过二分分裂方式繁殖；一旦食物匮乏，成百上千的单个细胞聚集成多细胞体，并逐渐分化为两种细胞：前柄细胞和前孢子细胞。多细胞体历经细胞丘、蛞蝓体、拔顶阶段完成分化和发育过程，最终前柄细胞分化为柄细胞，前孢子细胞分化为孢子细胞，二者组成的个体称为子实体。在合适条件下，孢子细胞萌发开始新生命周期；而柄细胞无论用什么条件都不能萌发，因此柄细胞是死亡细胞，柄细胞的形成是既是一个分化的过程，又是一个细胞凋亡的过程。目前认为细胞色素c不仅是呼吸电子传递链的一个载体，而且在细胞凋亡过程中也起着重要的调节作用。细胞色素c释放到胞质中可以激活凋亡蛋白激活因子-1和胱天蛋白酶-9，活化的胱天蛋白酶-9再激活胱天蛋白酶-3，最后导致生化和形态学上的凋亡现象。然而在盘基网柄菌的前柄细胞凋亡中，细胞色素c的作用如何不很清楚，并鲜有相关的报道。
本实验首先观察了野生型盘基网柄菌细胞KAx-3和突变型细胞AK127在剥夺食物的条件下，其多细胞的发育情况。我们观察到野生型细胞KAx-3经历趋化性聚集、细胞丘和蛞蝓体等三个阶段，最后形成由空心的柄和孢子体组成的子实体，顺利完成多细胞体的发育。而突变型细胞AK127，尽管发育早期细胞趋化性聚集，但到疏松聚集阶段发育停滞下来，细胞的分化停止，最后细胞解聚为松散的单个细胞。为了研究柄细胞的形成过程(即前柄细胞的凋亡过程)与细胞色素c的关系，我们过蛋白印记的方法和半定量RT-PCR的方法比较了16h、18h、20h三个多细胞发育阶段的前柄细胞和前孢子细胞中细胞色素c的定位变化情况和其表达水平的变化。得出以下结论：
1、发育16h-20h盘基网柄菌前柄细胞在凋亡过程中，线粒体内细胞色素c含量减少，而同时胞质中细胞色素c含量也逐渐增加，这说明二者是相关的事件。这些数据也提示在凋亡的前柄细胞中细胞色素c是由线粒体内释放到胞质中的；线粒体中仍然保留一定数量的细胞色素c事实说明细胞色素c并没有全部释放到胞质中，细胞尚未完全死亡，仍然需要一定量的细胞色素c参与呼吸链电子传递来保证能量的供给。
2、从胞质中和线粒体中细胞色素c的总含量比较来看，前柄细胞中的含量要高于前孢子细胞。从前柄细胞发育的三个时段来看，18h，20h时段呈现降低的趋势；说明前柄细胞随着凋亡进程，胞内细胞器，包括线粒体，因吞噬作用而逐渐减少，能量需求逐渐减少，细胞生命力也逐渐降低；
3、半定量RT-PCR检测结果发现各发育各阶段前柄细胞中细胞色素c的表达量明显高于同一阶段的前孢子细胞的表达量，从转录水平表现出凋亡对细胞色素c的需求，该结果也同时验证了免疫印迹实验数据。基于上述实验结果，我们推测这种调控与细胞凋亡进程密切相关，盘基网柄菌细胞整个发育周期大约是24h，所以发育到20h时，前柄细胞基本分化成柄细胞，换句话说，基本凋亡成柄细胞，细胞内大部分胞器，其中包括线粒体，被消灭，其结果是细胞色素c需求降低，随之细胞色素c的表达量也开始下降，使得凋亡后期细胞色素c总含量下降。
4、前柄细胞的凋亡过程是一个渐进的过程。本实验数据说明细胞色素c在一定程度上参与了盘基网柄菌前柄细胞的凋亡过程。