论文部分内容阅读
狐狸具有丰富多彩的毛色，是创制天然彩色毛皮的最佳材料，其颜色的变化对自身对抗疾病的能力和生产性能具有重要的反映作用。狐狸酪氨酸相关蛋白1(tyrosinase related protein1，TYRP1)基因和前黑素小体蛋白(premelanosome protein，PMEL)基因是调控狐狸毛色的主要候选基因。本研究旨在筛选调控狐狸毛色基因TYRP1和PMEL的启动子核心区域及转录因子结合位点，为探究该基因的表达调控机制提供理论依据，并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。
本研究通过全基因组测序技术，获得了狐狸TYRP1和PMEL基因上游启动子序列。下载EPD数据库中人和小鼠的TYRP1和PMEL基因启动子序列，与已知狐狸启动子序列进行BLAST比对。发现狐狸TYRP1基因已知序列-866/-512(355bp)区域和-866/-508(359bp)区域与人和小鼠TYRP1基因核心启动子序列相似度较高，分别为82％和74％。发现EPD数据库中存在人的两种PMEL基因核心启动子序列分别比对上狐狸PMEL基因已知启动子序列A区域-1669/-684(986bp)和B区域-1022/+37(1060bp)。根据以上比对结果，结合在线启动子预测软件结果，以已知狐狸TYRP1基因和PMEL基因5侧翼序列为模板，进行不同长度的启动子片段的PCR扩增，克隆到pGL3-Basic载体，构建不同长度缺失报告基因载体。将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞并进行活性验证。结果表明，狐狸TYRP1基因和PMEL基因的最高启动子活性片段分别为T4(-699/+35)和P1(-1162/+8)，该结果和狐狸TYRP1和PMEL基因启动子序列在EPD数据库中的比对结果相一致。根据构建载体活性值从高到无的降低趋势，以及结合转录因子结合位点在线预测结果，提示狐狸TYRP1基因在-656/-646、-598/-589、-539/-530和-163/-154位置可能存在Sp1和CREB的转录因子结合位点。狐狸PMEL基因在-966/-952、-912/-900、-750/-736、-712/-699和-682/-673位置可能存在Sp1和NF-1的转录因子结合位点。分别以最高活性片段T4和P1为模板，利用点突变技术对上述位置进行点突变，构建点突变载体。双荧光素酶报告系统检测结果显示突变载体的活性均降低。结论:狐狸TYRP1基因的核心启动子区域为T4(-699/+35);狐狸PMEL基因的核心启动子区域为P1(-1162/+8)。Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为狐狸TYRP1基因转录的正调控元件;Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673)为狐狸PMEL基因转录的正调控元件。
本研究通过全基因组测序技术，获得了狐狸TYRP1和PMEL基因上游启动子序列。下载EPD数据库中人和小鼠的TYRP1和PMEL基因启动子序列，与已知狐狸启动子序列进行BLAST比对。发现狐狸TYRP1基因已知序列-866/-512(355bp)区域和-866/-508(359bp)区域与人和小鼠TYRP1基因核心启动子序列相似度较高，分别为82％和74％。发现EPD数据库中存在人的两种PMEL基因核心启动子序列分别比对上狐狸PMEL基因已知启动子序列A区域-1669/-684(986bp)和B区域-1022/+37(1060bp)。根据以上比对结果，结合在线启动子预测软件结果，以已知狐狸TYRP1基因和PMEL基因5侧翼序列为模板，进行不同长度的启动子片段的PCR扩增，克隆到pGL3-Basic载体，构建不同长度缺失报告基因载体。将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞并进行活性验证。结果表明，狐狸TYRP1基因和PMEL基因的最高启动子活性片段分别为T4(-699/+35)和P1(-1162/+8)，该结果和狐狸TYRP1和PMEL基因启动子序列在EPD数据库中的比对结果相一致。根据构建载体活性值从高到无的降低趋势，以及结合转录因子结合位点在线预测结果，提示狐狸TYRP1基因在-656/-646、-598/-589、-539/-530和-163/-154位置可能存在Sp1和CREB的转录因子结合位点。狐狸PMEL基因在-966/-952、-912/-900、-750/-736、-712/-699和-682/-673位置可能存在Sp1和NF-1的转录因子结合位点。分别以最高活性片段T4和P1为模板，利用点突变技术对上述位置进行点突变，构建点突变载体。双荧光素酶报告系统检测结果显示突变载体的活性均降低。结论:狐狸TYRP1基因的核心启动子区域为T4(-699/+35);狐狸PMEL基因的核心启动子区域为P1(-1162/+8)。Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为狐狸TYRP1基因转录的正调控元件;Sp1(-966/-952)、Sp1(-912/-900)、Sp1(-750/-736)、NF-1(-712/-699)和NF-1(-682/-673)为狐狸PMEL基因转录的正调控元件。